Een Low-cost methode voor het analyseren van de inbeslagneming-achtige activiteit en beweging in<em> Drosophila</em
Summary
Met behulp van een webcam en een combinatie van gratis en goedkope software programma's, kan locomotief patronen in Drosophila melanogaster worden geanalyseerd om verschillen in de snelheid, afstand en tijd van de verschillende motorische activiteiten op te sporen.
Abstract
Video tracking systemen zijn op grote schaal gebruikt om Drosophila melanogaster beweging te analyseren en op te sporen diverse afwijkingen in locomotief gedrag. Hoewel deze systemen een schat aan gedrags-informatie kunnen verschaffen, kunnen de kosten en complexiteit van deze systemen worden onbetaalbaar voor vele laboratoria. We hebben een goedkope test voor het meten van locomotieven gedrag en inbeslagneming beweging in D. melanogaster ontwikkeld. Het systeem maakt gebruik van een web-cam om beelden die kunnen worden verwerkt met behulp van een combinatie van goedkope en gratis software op te sporen de afstand verplaatst te vangen, de gemiddelde snelheid van de beweging en de duur van de beweging gedurende een bepaalde tijdspanne. Om de bruikbaarheid van dit systeem te demonstreren, onderzochten we een groep D. melanogaster mutanten, Bang-gevoelige (BS) verlamden, die 3-10 keer meer vatbaar voor aanvallen-achtige activiteit (SLA) dan wildtype vliegen zijn. Met behulp van dit nieuwe systeem, waren we in staat om te detecteren dat de BS mutandist bang zinloze (BSS) vertoont lagere niveaus van verkennende motoriek in een nieuwe omgeving dan wild type vliegen. Daarnaast is het systeem gebruikt om te identificeren dat de metformin, die gewoonlijk wordt gebruikt om type II diabetes, vermindert de intensiteit van SLA in de BS mutanten.
Introduction
Gezien de korte levensduur en de robuuste genetische tools beschikbaar, Drosophila melanogaster is een uitstekend model voor het onderzoek naar de etiologie van verschillende ziekten en de onderliggende fysiologie van verschillende biologische processen. In veel gevallen is het voordelig om de effecten gedrags, genetische of farmacologische manipulaties hebben voor beweging bij deze modelorganismen 1,2 meten.
Er zijn verschillende methoden die algemeen worden gebruikt voor het meten vliegverkeer tweedimensionaal 3-7. Deze systemen kunnen het volgen van meerdere vliegen tegelijkertijd ondersteunen en kan de snelheid, opnemen weglengte meten en registreren van het percentage van de tijd een vlieg heeft bewegende doorgebracht. Ze zijn gebruikt om beweging te bestuderen in verschillende contexten, waaronder de effecten van geneesmiddelen op motoriek en seksuele dimorfe aard van vliegverkeer 6-9. Het grote nadeel van deze systemen is de kosten van het bijhouden systeem of de bijbehorende software en camera. In sommige gevallen kan deze uitgevoerd in de duizenden dollars. De kostprijs is een bijzondere zorg voor een laboratorium dat slechts beperkt gebruik van zo'n systeem nodig, bijvoorbeeld kwantificeren locomotief patronen van een onlangs geïsoleerd mutant.
Een eenvoudiger, maar minder robuuste methode is om systemen die beweging op te nemen op basis van het aantal keren dat een vlieg kruist een infrarode lichtstraal pad dat wordt geplaatst in het midden van een gesloten buis 10,11 gebruiken. Hoewel dergelijke systemen waardevolle informatie over beweging en slaap-waak cycli kunnen geven, ze kan over of onder de raming van de beweging omdat ze niet aan de werkelijke pad van de vlieg te vangen. Zo zal vliegen die aanzienlijke beweging vertonen aan de uiteinden van de buis zo laag verkeer meld vliegt maar met verdere hoge resolutie methoden zijn gebruikt om te proberen en omzeilen deze beperkingen 12.
Eenvoudiger en goedkoper nog klimmen apparaten die geotaxi metens, de opwaartse beweging van vliegen, via een buis of een reeks buizen 2,13. Hoewel dergelijke systemen zijn goedkoop en kunnen gemakkelijk geotaxis afwijkingen te laten, ze niet te veel andere aspecten van de beweging die van belang zijn voor de onderzoekers zou zijn vast te leggen.
Voor veel labs, een low-cost robuuste analyse systeem dat eenvoudig te installeren en te bedienen zou een voordelige hulpmiddel voor het karakteriseren van gedragsverschillen in D. melanogaster stammen zijn. Hier beschrijven we een test waarmee kan worden opgezet voor minder dan tweehonderd dollar en is in staat om informatie over de weg, de snelheid en de duur van de beweging van de vlieg geven. Om de werkzaamheid van de test tonen presenteren we gegevens aantonen dat het kan worden gebruikt voor het identificeren, 1) een motorische defect in een Bang-gevoelige (BS) mutant die gevoelig is voor aanvallen en 2) het vermogen van het geneesmiddel metformine, die wordt vaak gebruikt voor de behandeling van type II diabetes, de intensiteit van aanvallen-achtige activiteit (SLA) i verminderenn twee BS mutanten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij de behandeling van motorische of bewegingspatronen in Drosophila, is het nuttig om in staat om informatie over de afgelegde afstand, de snelheid van de beweging en het bewegingspatroon te halen. Om deze informatie te halen, is dure apparatuur oudsher werkzaam, dat is vaak onbetaalbaar voor kleinere laboratoria of laboratoria die willen dergelijke testen spaarzaam 4,8,9 gebruiken.
De hier beschreven test kan worden gebruikt om te bepalen de afgelegde afstand (f…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen ook dank aan Kris Brander, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, en Megan Hyde uiten voor hun werk in de fine-tuning van deze test.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number/Model | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5cm petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | Built from scrap material. | Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. | |
Referencias
- Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
- Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
- Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
- Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
- Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ”Tracker” program. PLos ONE. 7, (2012).
- Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
- Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
- Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
- Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genética. , 187-534 (2011).
- Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).
