神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

以降の手順は、カリフォルニア大学リバーサイド校の制度的動物実験委員会によって承認されている。 1。インキュベーションチャンバーとスライスホルダーの構築インキュベーションチャンバーを構築する：毒性のない材料からインキュベーションチャンバーを構築します。チャンバは空気循環を制御していることを確認する、浮くスライスホルダのためACSFに十分な量を保持し、酸素ラインからのガス分散がで発生しながらスライスホルダは、チャンバの一端に浮くことができるように十分な大きさであるもう一方の端。その気密蓋（ 図1A）とピペット貯蔵容器の引き出し部分がうまくこれらの基準に適合します。 約1¼の上から容器の側面に小さな穴をドリル側から¼。穴からフレキシブルチューブの部分に合わせます（ 図1B）。ふたを閉じたときにチューブが、それが解決策を超えているので、十分に高く、まだ、圧縮されないように、十分に低く、ドリルするように注意してください。 酸素ラインとチャンバとの間の水密シールを形成するシリコーン継ぎ目シーラント（「水槽シームシーラー」）を適用する。 雄型ルアーフィッティングを使用して、ガスタンク（95％酸素、5％二酸化炭素）への管の「外側」端を接続します。カスタムフィットのため、カットに合い、自然なベベル200μlのピペットチップ（ 図1C）。 1対6のラインプラスチックマニホールドにチューブの「内部」の端を接続します。カットにフィット各マニホールド入口（ 図1D）に620μlをエッペンドルフmicroloaderピペットチップ。 microloadersの細かい開口部が小さい気泡の安定した流れを生成するのに最適です。 換気を可能にするために、コンテナ（ 図1E）の蓋に2小さい穴を開けます。 スライスhを構築する古い：スライスホルダーフローティングバブルラック（ 図1F）から作られています。 バブルラックの一番 "足"を削除し、約1¾インチにトップをカット 8ウェルスライスホルダー（ 図1G）を作成する（このような標準クレイジー接着剤として）シアノアクリレート接着剤を使用した丸ラックの一番下にナイロンメッシュ素材の部分を接着します。各ウェルは、単一のマウス海馬スライスを収めることができます。 1インキュベーションチャンバーの最後に、他端にmicroloaderマニホールド装置のスライスホルダーを取り付けます。 microloaderのヒントチャンバ床（ 図1H）に載ることができます。この設定は、上部および急性海馬スライスの底部の両方に十分な酸素化を確実にするために、気泡は、スライスの攪拌を最小限にし、海馬スライスでの気泡の直接接触を防止するために、直接スライスホルダの下方に抜けないように設計されている。 インキュベーション室をすすぐ各実験後のddH 2 Oで徹底的にDスライスホルダー、そして、毎週70％エタノールで除染。異なる溶液内のスライスをインキュベートした場合に、複数のチャンバ/スライス·ホルダーが必要となる。 2。ソリューションや医薬品人工脳脊髄液（ACSF）：125のNaCl、2.5のKCl、2.5のCaCl 2、1.3のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、26.0炭酸水素ナトリウム、15：（単位：mm）は、次を使用してのddH 2 Oで標準ACSF 4Lのを準備しますグルコース、および0.1トロロックス。浸透圧計を用いて溶液の浸透圧を測定し、それは〜310ミリオスモルに来る必要があります。実験条件のためのACSF組成物は、（プロトコル3を参照）を以下に記載する。オートクレーブしガラス瓶に0.22μmのボトル·トップ·フィルターを使用してすべてのソリューションをフィルタリングします。解決策は、月まで4℃で安定している。 スライスバッファ：125のNaCl、2.5のKCl、3.8のMgCl：（単位：mm）を含む修正されたACSFを使用してスライスを準備しますl 2は 、1.25のNaH 2 PO 4、26.0のNaHCO 3、15グルコース、および1.3アスコルビン酸。浸透圧計を用いて溶液の浸透圧を測定し、それは〜310ミリオスモルに来る必要があります。スライス·バッファ内の塩化マグネシウムと塩化カルシウムの交換は、スライスの健康を向上させます。 ローダミン101（SR-101、1μM）は、急性海馬スライスにおける星状細胞を同定するために使用される。 125のNaCl、2.5のKCl、0.5のCaCl 2、6のMgCl 2、1.25のNaH 2：（単位：mm）を以下のように調製変性低カルシウムACSF 100mlに60.67 mgのSR-101を希釈することにより、SR-101の1 mMストックを作るPO 4、26.0のNaHCO 3、15グルコース、および1.3アスコルビン酸。低カルシウムACSFの浸透圧が約310 mOsmであることを確認します。ロード用の変性低Ca 2 +のACSFに1 mMのSR-101株を千倍に希釈する。 4℃で、最終的なSR-101のソリューションを保存し、実験に必要とされるまで、光から保護。 3。 Lの操作中期神経ONG急性海馬スライス料金発射長期ニューロンの発火率を操作するために別の実験で2インキュベーションプロトコルのいずれかを使用します。 神経発火を抑制：テトロドトキシン（TTX、1μM）でインキュベート。注意：十分な量で摂取した場合、それは致命的なことができますように注意して、TTXに取り扱ってください。手袋とゴーグルを推奨します。 TTXは完全に急性スライスAP主導の神経発火を廃止。 3.5 mMのK + ACSFでスライスをインキュベート、プラス実験条件での1μMのTTX。対照条件では、TTXずに3.5 mMのK + ACSF内のスライスをインキュベートする。二つの条件を比較すると、アストロサイトのGq GPCR活性のアップスケーリングの効果を明らかにする。 TTX処理の効果を最大にするために（、2.5mMのK +を言うこととは対照的に）、3.5mMのK + ACSFは、制御条件となる。 – または – 上記の神経細胞の発火を高める基礎速度：高カリウムでインキュベート：細胞外のK +濃度を大きくすると神経細胞を脱分極し、その基礎発火率を向上させます。 5.0 mMのK + ACSF中でのインキュベーションを大幅に2.5 mMのK + ACSF 15と比較して、神経細胞の活動電位周波数を上昇させる。実験条件のために5.0 mMのK + ACSFでスライスをインキュベートし、制御条件のために、標準的な2.5 mMのK + ACSFでスライスをインキュベートする。 2条件間の比較は、アストロサイトのGq GPCR活性におけるダウンスケーリング効果を明らかにする。 4。急性海馬スライスの準備暖かい回収室の設定： 35℃に水浴を温めると、内部の準備インキュベーション室を置く。インキュベーション室（ 図1G）内ACSFの高さまで水で水浴を埋める。 95％O 2、5％のCと実験群と対照ACSFに酸素O 2。 microloaderマニホールド装置から放出された気泡が小さく、豊富でなく、穏やかである必要があります。室内のACSFの目に見える動きがあってはならない。 氷のように冷たい解剖室の設定： 氷の2バケツを取る。氷の1バケットにバッファをスライスして、約300ミリリットルのボトルを置き、20分間、95％のO 2、5％CO 2で酸素を保つ。ちょうど氷の表面の下に、他の氷のバケツに100ミリメートルペトリ皿水没。ペトリ皿の側面が氷に直接接触していることを確認してください。ペトリ皿にいくつかのスライスバッファを注ぎ、それは同様に酸素を保つ。 以上1分間ペトリ皿中の氷冷スライスバッファにそれを沈めることによって、単一のエッジかみそりの刃の刃先を冷やす。 ビブラセットアップ： ビブラトームをオンにして、排水が閉じていることを確認してください。 振動切削室を確保登米切削室の周りの流氷。 0〜4℃に予冷工場は5分間70％エタノールにそれを浸漬してからのddH2Oですすぐことによりダブルエッジかみそりの刃からグリース削除します。慎重に半分にカット（刃を曲げていない）と、切断ブロックの上半分ブレードをマウントします。 マウス脳を削除する： キムワイプまたはコットンボールに染み込ん0.5ミリリットルイソフルランでプリロード小室に一二から一八日齢のC57BL/6Jマウスを麻酔。優しく痛み反射がないことを確認するために、動物の足の指を挟ま。 鋭いハサミを使用して、マウスを斬首し、小さなピンセットを用いて頭皮を削除します。縦の割れ目に沿って嗅球に小脳から頭蓋骨をカットし、小さな骨のはさみを使用してください。小さなピンセットを用いて頭蓋フラップを取り外します。優しくへらで脳を削除し、ペトリ皿中の氷冷酸素化スライスバッファにそれを沈める。 Bisec冷却及び酸素化のためのより多くの表面積を可能にするために、ペトリ皿中で冷却かみそりの刃でマウス脳はt。二等分半球が2〜3分間、氷冷スライスバッファに座ってみましょう。脳は完全にクールで、より強固になる必要があります。 ビブラトームのプラットフォーム上でシアノアクリレート接着剤の薄層を適用します。嗅球を前方に向けた状態で、最大のプラットフォームカットサイドダウンと側面に両半球を接着します。切削室内の作業台を固定し、その後、氷冷で十分に酸素スライスバッファを切断室を埋める。 ビブラトームを使用して厚さ300μmの矢状スライスを準備している間、切断室を酸素化し続ける。 85 Hzで、0.20ミリメートル/秒の前進速度、および1.40ミリメートルの振幅の周波数でスライスを切った。注：私たちは健康的な急性海馬スライスを製造するのに単一の最も重要な変数はビブラトームの品質であることを見出した。当研究室では、ライカのVT 1200 S磁石を使用していますicは "z"の振動を低減するVibroCheckのビブラトームで駆動する。 スライスした後、鋭利なピンセットを用いて、各矢スライスのうち海馬および隣接嗅内皮質を解剖。ビブラトームの切断室内の氷のように冷たい、よく酸素化スライスバッファにこの手順を実行します。それはスライスの取り扱いを最小限に抑えることが鉗子のシャープは、スライスの健康にとって非常に重要である。 ガラスパスツールピペットの長い先端を破壊し、ピペット球で破損部品をトッピングによりトランスファーピペットを作る。これはスライスを転送するピペットの大端の使用を可能にする。 （材料の表を参照）大端に綿栓なしでピペットを注文してください。スライスは非滅菌条件下で調製されるように新しいピペットを調製し、各実験のために使用されるべきであるが、それは、使用前にピペットをオートクレーブする必要はない。 35℃の水中でのインキュベーション室にそれぞれ海馬スライスを転送する風呂、スライスホルダーの各ウェルの中にACSFにホールピペットを浸漬し、スライスを吸引することにより。このプロセスの間にスライスの動きを最小限に抑えることができます。徐々に温度を「ランプ」よりも品質が良いスライス暖かいインキュベーション風呂結果とスライスの直接転送。 海馬スライスは、次のように分解45分、合計、温水浴で回復することができ：なしに（低カルシウムACSFに転送して、低カルシウムACSF中に希釈し、1μMSR-101で20分間のスライスをインキュベートSR-101）で10分間。その後、温かいインキュベーションの残りの15分間制御するスライスまたは実験ACSFを転送します。 45分ウォーム回復後、慎重にベンチトップに35℃の水浴からインキュベーションチャンバーを移動し、スライスはボーラスロードを開始する前に、3時間の総インキュベーション時間、室温でインキュベートし続けることを可能にプロトコル（以下を参照）。 </ol> 5。のCa 2 +指示薬とアストロサイトのボーラスのロード準備のCa 2 +指示薬ボーラスローディング色素： 色素（50μg）を、各バイアルには、新鮮なジメチルスルホキシド（DMSO）、徹底的に渦の3.87を添加する。 DMSOの鮮度が良いのロードのために重要であるため、新鮮なアンプルを毎回開いて割れ。 徹底的に20％プルロニック酸と渦の9μlに混ぜる。 10μMの最終色素濃度のために、適切な実験または制御ACSF、よくボルテックス100μlの色素を混ぜる。 遠心フィルターチューブを用いて溶液を濾過する。このステップは、色素の排出中に目詰まりローディングピペットを防ぐことができます。 ホウケイ酸ガラスキャピラリーからピペットを作製した色素溶液を充填したときに約1.3MΩの抵抗に引っ張ら。 顕微鏡で使用するために設計された記録室へ海馬スライスを置き連続的には（1.5ml /分）中でインキュベートした同じ組成の酸素化ACSFで灌流する。コントロールおよび実験条件間の代替の海馬スライスを選択する。 不健康探し海馬スライスを捨てる。スライスの品質にも指定された実験内で変化します。スライスの健康を定量化するには、設定された基準がありません、したがって、スライスの健康の決定は主観的で、主に経験に基づいている。 一般的に言って、滑らかで登場する面で健康的CA1錐体細胞の割合が高い（ 図2A）を持つスライスを保つ。 CA1錐体細胞が中枢神経系の傷害に特に敏感で脆弱なので、健康的なCA1錐体ニューロンの大部分（≥75％）を有するスライスを受け入れるか、拒否するための便利な基準があります。 約> 25％死んだ神経細胞を持っているスライスを捨てる。死んだニューロンは目玉焼きのような外観（ 図2B）を持っています。注：我々はヘクタールカットの角度が神経細胞が健康かどう表示されるかどうかに大きな役割を果たしていることを観察したVE。神経細胞の樹状突起は、（スライスの外に）上向きに突出している場合は、神経細胞は、ほとんどが死んでいるだろう。ニューロンボリュームのような大きな割合が、樹状ツリー内に含まれているので、これは樹状突起を切断する細胞に対して致死的であることが考えられる。樹状突起は、スライス面から下向きの角度にまたは並列に投影している一方、健康な神経細胞の割合が高いがあるでしょう。時には、そのため、ニューロンは反対側に見てスライスし、健康の一方の側にほとんどが死んでいるだろう。 微分干渉コントラスト（DIC）光学系を用いてサイズ、形態、および場所に基づいて40〜70ミクロンのスライス面の下SRアストロサイトの適切なフィールドを探します。 色素溶液をガラスピペットをロードし、標準のパッチクランプ微小電極holdeを使用して、このフィールドの上にスライスの表面にそれを下げるR。スライスの表面にピペットで、吐出染料を開始するために、ピペットに背圧を適用します。色素の排出は、DIC光学系と、このような緑色染料のための488のラインとして適切なレーザーの両方の下に表示されます。 ゆっくりと約40μmマイクロマニピュレーターを用いて、スライス面の下にピペットを下げ、染料が約45〜60秒間取り出すことができます。その後、さらに35ミクロン（スライス表面下75μm）をピペットを下げ、約45〜60秒間の色素を取り出します。ゆっくりスライスからピペットチップを撤回。短い注入時間が長いほど噴射記録の信号対雑音比を減少させるバックグラウンドローディングを増加する傾向があるのに対して、不十分な色素負荷をもたらす可能性がある。 アストロサイトの数が多い色素を取ることを確実にするために、少し離れ第2の色素のボーラスを注入するために、通常は便利です。バックのスライスの表面にピペットを上げ、ピペットが詰まっていないことを確認し、その後、MO放線層に沿って、約80〜100ミクロン離れて最初の注射部位からピペットを見る。このサイトでボーラス注射を繰り返します。 アストロサイトは、色素を取るとバックグラウンド信号を減少させるためにするための撮像前に30〜45分を許可します。この時間の間に灌流チャンバー内のスライスにしておきます。このインキュベーション時間は、実験の合計4時間の処理に組み込まれていることを確認してください。次のスライスを取得し、ステップ5.2から5.8を繰り返します。 6。海馬スライスにおける記録自発的ではGq GPCRアゴニスト誘起アストロサイトのCa 2 +の活動イメージングのための共焦点顕微鏡を設定する： 高暴露を漂白および/または光毒性を染色するために導くことができるように、レーザ光のスライス曝露を制限することは、最も重要である。高い光学倍率または増加ズーム設定を使用すると、画像化されたフィールドへの露光が増加します。従って、高電子増倍settin各レーザのためのデフォルト値を設定するgで、1×利得および0.5％レーザ出力パワー。 アストロサイトのプロセスのより良い視覚化のために1.5倍ズームを適用します。 フィールドの解像度を512×512ピクセルに設定。 〜一方通行のスキャンモードを使用して、1スキャン当たり1.2秒である、最速、スキャン速度を設定します。 488nmのレーザの503から548ナノメートル、および559 nmレーザーのための624から724 nmのバンドパスフィルタを用いて発光スペクトルを収集する。これらの設定は、アストロサイトの細胞体および主要工程を観察するのに十分な解像度で比較的速いス​​ピードで〜5-8アストロサイトの分野の画像化を可能にする。理想的には、フィールド内のアストロサイトがはっきり見ることが十分に明るいが、どのピクセルが飽和せずになります。 + 559 nmのレーザーを使用して、SR-101 colabelingを可視化することにより、星状細胞のような色素のCa 2を搭載した細胞の同一性を確認する。 アストロサイトのCa 2 +の活動を記録する。 関心領域にわたって画像取得ソフトウェアを使用してボックスを描画する（RO星状細胞の細胞体上に、この場合には、細胞内）である。ボックスは、可能な最良の信号対雑音比を達成するために、背景画素を含むべきではない。基準となる背景の上に1ボックスを描画します。 実験の残りを通じて実験ACSFプラス1μMのTTX（アブカム）に灌流を切り替えます。これは、任意の可能な神経細胞のAP主導のアストロサイトのカルシウム応答を排除します。アストロサイトのCa 2 +濃度の残りの増加はその後により量子的小胞リリース、構成的（基礎）GPCR活性、またはその両方のメカニズムのいくつかの組み合わせになります。 すべてのROIからの時間の経過の記録蛍光。ベースラインを超える蛍光の任意の増加は、細胞質のCa 2 +濃度16の増加を示しており、アストロサイト10、17、18、したがって、GPCR活性。 TTXによるアストロサイトの受容体上の任意の可能な初期のスケーリング効果を避けるために、40分以内に完了FR実験OM時間は、1μMのTTX灌流が始まった。 自発的なCa 2 +の活動のベースライン記録の10分を取得した後、連続的に増加する濃度で（例えばDHPGなど）興味のアゴニストを適用する。可能な受容体脱感作を減少させるために、アプリケーション間の5分の最低限のままにしておきます。 録画の終了時に、そのままアストロサイトのGq GPCRシグナル伝達経路のポジティブコントロールとして、他のアストロサイトのGqファンGPCRのための薬のカクテルを適用します。アゴニストカクテルの構成要素は、目的の受容体に依存します。 Gq共役GPCRの各々の10μMの[肺mAchR】ムスカリン性アセチルコリン受容体、[H1R】ヒスタミンH1受容体を刺激するために、ヒスタミン、カルバコール、および2Naを-ATPアゴニスト、およびプリン受容体[P2YR]は、それぞれ、一般的に使用されるアゴニストのカクテルである。 後の実験画像取得： 記録のCa 2 +の完了時に、488 nmおよび559 nmのレーザーで静止画像を撮影、fはまたはアストロサイトのIDとROIの配置の後の確認。 （ 図2A）データに影響を与えるレーザ光 ​​強度についての懸念が存在しなくなったように、レーザパワー及びHV設定は、共局在化のための最適な画像を得るために、この時点で自由に変更することができない。 繰り返しますが約8スライスと40アストロサイト/グループ合計で6.1から6.3を繰り返します。スライスは、3つの異なるマウスの最小値から来る必要があります。 7。アストロサイトのCa 2 +活性の分析 Ca 2 +の上昇を定義する：Ca 2 +のトランジェントを定義する標準化はしっかりと科学界では確立されていない。以下は、ベースラインノイズから偽陽性事象の検出を制限しながら、感度を最大化する典型的なプロトコルである。 別の研究室部材は盲目的にそれらを分析するために、各スライスの数値コードを割り当てている。分析の最後に、それぞれのスライスをデコードします。 オフライン画像解析ソフトウェアを使用して、自発的かつ誘発アストロサイトのCa 2 +上昇を分析します。再描画および/または所望に応じてサイズ、形状、およびROIの位置を調整する。 のCa 2 +上昇としてベースラインを超える蛍光強度のスコアが増加するピーク振幅は、少なくとも2つの連続したサンプル点についての平均ベースライン蛍光の30秒の平均を超える2つの標準偏差（SD）よりも大きい場合。特にノイズの多いレコーディング（低い信号対ノイズ）では、この基準は、平均ベースライン蛍光上記3 ​​SDに調整される必要があり得る。蛍光強度が平均を上回る標準偏差を超える前に、最後のデータ点として各々のCa 2 +上昇の開始を定義する。 多峰対の連続単峰事象を区別。 ＆用蛍光強度は（平均ベースライン値2 SD下回る）、ベースラインに戻らないとき、「多峰」などのイベントのスコア＃8804;ピーク間の9連続したデータ·ポイント（10.8秒）。したがって、単一のピーク事象は、それらの間に、10以上の連続した​​ベースラインのデータポイントを有するであろう。 蛍光強度が少なくとも3.6秒間ピーク振幅（ピーク値の±10％）を維持した場合に「プラトー」型応答などのイベントを分類します。 自発的なアゴニスト誘発カルシウムトランジェントの振幅、周波数、および動態を分析します。 最も高い強度値を持つデータポイントとしてCa 2 +の上昇のピーク振幅を定義します（「多峰」の回答例で最初のピークを使用し、 図2（b）参照 ）。 ピーク振幅に対応する応答の発症との間の時間差として立上り時間を算出する。 NOTE：0〜100％の立ち上がり時間は時間値を取得するためにデータポイントの十分な数を有するために使用される必要があることができ、走査速度は、ここで重要な変数である。 時間と待機時間を計算する応答発症に対するアゴニスト灌流の開始の間。時間がある限りウォッシュイン時間は、応答待ち時間を計算する際に交絡を作成し、脳スライスで、より有用な尺度である上昇。 スチューデントの独立したt検定を用いて、各パラメータの2群間で統計的に有意な差があるかどうかを判断します。 'N'のように、星状細胞の数を使用してください。対照群と処置群の間のCa 2 +の活動パターンを比較するためにピアソンのカイ二乗検定を使用してください。対照群と処置群との間の特定のCa 2 +の活動パターンの割合を比較するためにフィッシャーの正確確率2テール·テストを使用してください。 * P <0.05、** P <0.01、及び***はp <0.001などの違いを表現する。