ScanLag：ハイスループットコロニーの成長の定量化とラグタイム

遅延時間分布抽出の一例として、 図5は、スクリーニングアッセイにおいて行われるであろうように、経時的に一つのプレート上の特定の特性を持つ各コロニーを識別し、追跡するScanLagの能力を示している。 微生物の培養が不均一である場合、異なる亜集団は、アッセイ中に自分自身を明らかに可能性があります。例えば、 図6は、出現定量化を示すので、E.の突然変異株における二峰遅延時間の分布を明らかにする大腸菌。 細胞の増殖速度は、コロニーの出現時間に影響を与える。コロニーを同じ割合で成長すると、後期外観はラグタイム（ 図7）に帰することができる。 この方法は確かに単一セルの遅延時間を測定することを検証するために、我々は、単一細胞顕微鏡を用いて得られたものとScanLag結果を比較し;この検証は、お得です。以前の出版物7で詳しくribed。この方法は、顕微鏡を用いて評価することができるよりも多くの細胞のモニタリングを可能にします。顕微鏡を使用してScanLagを使用して得られたディストリビューションは、大部分が重複している。 ScanLag分布がやや広い。理論的な分析は、分割時間の標準偏差のオーダであることが広がりを予測する。成長時間は各菌株ごとに異なる​​場合には、外観の遅れの原因は、他の方法を用いて検討しなければなりません。 後でコロニーの外観に早期出現したコロニーの影響を調べた。対照実験7は、後述外観限り、プレートあたりのコロニーの総数が（ 図8）200を超えないように影響されなかったことを確認した。別の対照実験は、プレート上のコロニーの位置が、その出現時刻7に影響を与えないことを確認した。 Pの分析lates増殖培地または微生物の種類に存在する栄養素に応じて変更が必要になることがあります特定のしきい値に校正されています。それにもかかわらず、分析は、 図9に示すように、閾値の広い範囲のために非常に堅牢である。 図1。コロニーの出現分布を作成するために必要な手順の概略図。 図2。付属のスキャナ、およびコンフィギュレーションファイルの名前を示すデバイスマネージャのスクリーンショット。 拡大表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のバージョン。 図3。スキャンマネージャのスクリーンショット。 図4。ScanLagAppのスクリーンショット。プレートの画像は、左ペインにあり、マニュアルに詳述されるよう各コロニーの成長曲線は、右側のペインにあります。 2つ以上のコロニーがマージするときコロニー面積曲線のいくつかではスパイクが発生します。コロニーのマージが起きると、これらのコロニーの面積は接合領域であると考えられる。 図5つのプレートの分析の代表的結果（A）実験の終了時検出アプリケーションの出力の画像。各コロニー領域は、同定および着色固有のID番号が付与されている。矢印はコロニー（強度閾値に基づいて検出されるB.において測定代表コロニーを指すが、LB寒天またはM9寒天培地上の大腸菌コロニーの場合、この閾値は0.03である。他のメディアまたは細菌の場合、この閾値は、機能ProcessPicturesに調整することができる）。 （このしきい値は、関数MatchColoniesで変更することができる）10以上のピクセルがカウントされているオブジェクトのみ。コロニーの検出は、約10 5の細菌から始まります。このプレートの4つの代表的なコロニーの時間に対するピクセル単位面積（B）をプロットします。コロニーが検出されたときに各コロニーの「出現時間」である。各コロニーの '成長時間は、「あちこちに成長するための時間として定義される（それらの境界は機能getAppearanceGrowthByVecを使用して調整可能です）80ピクセルに20ピクセルをメートル。ソフトウェアは、上限に達する前にマージされたコロニーを除外します。その特性に応じて、特定のコロニーの同定は、識別番号と各コロニーに割り当てられた色に簡単に感謝です。例えば＃1のコロニー、56、77および124は、両方のグラフで強調表示されます。 図6外見定量化は、二峰性遅延時間の分布を明らかにすることができる。2つの異なる株のための出現回数ScanLag分析のヒストグラムの比較。青線：野生型株指数関数的に成長している（合計：1,320コロニー）;遅れ細菌（：1,529コロニー数）で強化され、赤のラインの高持続性変異体。 （A）は正規外観ヒストグラム。ピーク指数関数的に増殖する細胞の出現の検出可能なコロニーに成長するのにかかる平均的な時間である。挿入図：二峰遅延時間の分布を示す対数等間隔のビン上の実際の遅延時間を取得するために指数関数的文化のピークの時間を差し引いた後の変異株の同じヒストグラム。 （B）は対数目盛で、（A）と同じデータの生存関数。この表現は、変異株の後期外観テールを強化します。 図7外見分布及び成長時間分布（A）及び（B）は、二次元の出現時刻のヒストグラムおよび2つの異なる条件（ソフトウェアが上限に到達する前にマージされたコロニーを除く）の成長時間を示している。 （C）のヒストグラムを比較する成長時間（D）は似ているのに対し、2株の出現時間の差は、表示されます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図8は、初期のコロニーの出現は、後にコロニーの出現を妨げない。（A）単独めっき野生型細胞の時間分布遅れる。 （B）許容温度への転送後に、一人で低温感受性株の時間分布ラグ。 （C）は、同じ条件下で一緒にプレーティングし、両株の時間分布遅れる。黒い線は別々に歪みを測定する際に得られたデータに基づいて予想される分布を表す。良いA予想と測定された分布間greementであれプレートあたりのコロニーの総数が200未満であるとして得られる。 。図9は、検出閾値は、コロニーの外観分布の形状に影響を与えないコロニーの出現分布は二つの異なる閾値の大きさを使用して同じデータセットを分析した。 （A）しきい値サイズは10ピクセルです。 （B）は 、しきい値サイズは50ピクセルです。ヒストグラム当たりの細胞数：約。 1500。異なる検出閾値は、検出時間のずれが生じる。 図10。温度安定性測定のACR電源管理なしのスキャナ上に成長させた枯草枯草菌のコロニーを有するプレートのOSSスキャナの表面（A）画像。表面が底に暖かいので、コロニーが速く成長。プレートの横に緩やかなラインは、熱勾配の概略図である。 （B）温度安定性は、スキャナの表面を横切って配置された2つの熱電対で測定した。スキャナは、各走査中に、時間をかけて加熱する。 （C）は、電源管理を使用すると、温度が均一であり、コロニーは同様の速度で成長する。 （D）電源管理モジュールと、（B）と同じ。 ±0.2℃の温度安定性 図11。外観分布の差はディが原因である可能性があり固体培地の量のfferences。同一の細菌培養物は、寒天表面の異なる高さで、その結果、LB寒天の異なるボリュームを有するプレート上にプレーティングした。異なる高さは、プレートの異なる不透明度、したがって異なる検出時間につながった。インタープレート差がチェックされ、異なる高さの条件の違いました。 LB寒天の30±0.5ミリリットルの等容量のプレート間の（A）の代表的な違い。異なる高さの条件との間の（B）の違い：外観分布は30±0.5ミリリットル（緑）の40±0.5ミリリットル（青）で、20±0.5ミリリットル（赤）の容積を有するプレートを測定した。各条件は、6種類のプレートの平均である。限り板の体積が±5ミリリットルの範囲内にあるように、不透明度は同様であり、同様の外観時間分布をもたらす。