ScanLag: عالية الإنتاجية الكمي لمستعمرة النمو والفارق الزمني
Summary
ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.
Abstract
Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.
Introduction
وقد تطورت البكتريا للرد على العديد من الظروف المجهدة. وثمة سمة عامة من التكيف مع الإجهاد هو تغيير في ديناميات النمو 1،2. وتتميز ديناميات النمو في الغالب من قبل معلمتين: معدل النمو الأسي والوقت الضائع، أي الوقت اللازم للتكيف مع الظروف الجديدة. في حين أن عددا كبيرا من أساليب إنتاجية عالية التركيز على قياسات معدل النمو، وتأخر الوقت غالبا ما تكون المعلمة تجاهلها، على الرغم من أنها هي المعلمة حاسمة لتوصيف التكيف مع الظروف الجديدة. وقد جرت العادة على إجراء القياس الكمي للتكيف مع الظروف المتغيرة باستخدام الطرق اليدوية شاقة 3،4. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير تقنيات متقدمة لتحليل الخلايا واحد 5،6. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الصعب التمييز بين النمو الطبيعي بعد التأخر في النمو (أي تأخر الوقت) 2،3 من النمو البطيء. شيد طريقة الآلي، ScanLag 7، لالتمييز بين هذه الظواهر مماثلة اثنين.
وكشفت مثال صارخ على أهمية دراسة توزيع الوقت الضائع تحت العلاج بالمضادات الحيوية. المضادات الحيوية والضغوط أخرى كثيرة قتل الخلايا بنشاط متزايد فقط، وبالتالي، والخلايا التي هي "متخلفة" محمية 8. لرصد تأخر الوقت، يمكن للمرء أن يلاحظ خلايا مفردة تحت المجهر ورصد الوقت لدوري الدرجة الاولى. والعيب الرئيسي لهذه الطريقة هو أن النطاق الزمني ديناميكية محدودة؛ تغطية تلك الخلايا التي تنمو في وقت مبكر السطح بمعدل هائل، وخفض بشكل فعال في نمو الخلايا وقتا أطول مع تأخر. استخدام غرف تدفق تلتف إلى حد ما هذا 5، ولكن يمكن تتبع عدد محدود من الخلايا والتي لا يمكن لاحظ جزء من البكتيريا التي الخروج من مرحلة متخلفة بعد الغالبية العظمى من السكان قد بدأت في الازدياد. على الرغم من هذه القيود، وقد قيمت عدة دراسات تأثير مستوى ديويؤكد fferent على توزيع الوقت الضائع باستخدام المجهر خلية واحدة 9-12. طريقة أخرى لمراقبة توزيع الوقت الضائع من خلال قياسات التعكر 13،14. تزرع العديد من الثقافات موازاة ذلك، بدأت كل من خلية واحدة، في قارئ الكثافة البصرية الذي يقيس عدد من البكتيريا في الثقافة على مر الزمن. هذه الطريقة محدودة بسبب دقة استقراء وإلى عدد من الآبار في طبق من ذهب.
وقد تم تطوير أسلوب مؤتمت، ودعا ScanLag، التي تمكن مرات تأخر النمو والتوزيعات الوقت على أن يقسم، حتى بالنسبة لنسبة صغيرة من البكتيريا في عدد السكان التي لديها مرات فارق زمني طويل جدا. ويستند هذا الأسلوب على الكشف عن المستعمرات على لوحات أجار التقليدية المغذيات 15 (الشكل 1). لأتمتة الكشف 16،17 مجموعة من الماسحات الضوئية التجارية 18 التي يتم إخراج البرنامج في المنزل للحصول على دوري الصور من لوحات، وهندسيا. وكان البرنامجتهدف إلى تحليل الصور تلقائيا واستخراج المعلمات الكمي 19،20، مثل الوقت من ظهور كل مستعمرة والنمو الوقت من كل مستعمرة، الذي يعرف هنا باسم الوقت لتنمو من 20 بكسل إلى 80 بكسل. هنا نقدم طريقة بالتفصيل، بما في ذلك الإعداد للنظام واستخدام البرمجيات الآلي تحليل الصور التي تم تحسين واجهة المستخدم مع أفضل.
هذه الطريقة يمكن تكييفها لقياس الخصائص الأخرى من المستعمرات، مثل التشكل واللون. وقياس هذه الأنواع من المعلمات السماح باستخدام النظام في phenomics متعددة الأبعاد. كما يكشف الأسلوب مستعمرات من الخلايا واحدة، يمكن للنظام كشف الظواهر الجديدة التي لا يمكن قياسها بواسطة القياسات على مستوى السكان. تقنية تمكن الكشف واسترجاعها من المتغيرات نادرة، ويسهل الكشف عن الصفات المطلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
وغالبا ما ينظر إلى الأساليب المجهرية يعتمد على الملاحظة المباشرة ب "معيار ذهبي" لدراسة السلوك وحيدة الخلية. يوفر ScanLag، والتي تمكن من قياس توزيع مرات تأخر في السكان البكتيرية والبيانات في اتفاق جيد مع التوزيع تم الحصول عليها من تحليل وحيدة الخلية ويحقق الإحصاءات أعلى من ذلك بكثير.
العديد من الخطوات الحاسمة يجب أن تؤديها لهذا الأسلوب للعمل بشكل جيد: أولا، لا نساوم على القرار الماسح الضوئي، الذي ينبغي أن يكون 4،800 9،600 س للحصول على صور جيدة. الثاني، أن ندرك أنه بدون وحدة إدارة الطاقة (الخطوة 1.6)، ودرجة الحرارة التدرج قد وضع على سطح مسطحة وتؤثر على النمو. خطوة هامة أخرى هو الترشيح من العيوب مثل الغبار التي قد تم فرزها عن طريق الخطأ كما المستعمرات من قبل البرنامج. الطرح خلفية المدمج في البرنامج عادة ما يتغلب على هذه العيوب، ولكن لديها المستعمرات أحيانا "كاذبة" لتتم تصفيته يدويا.
الخطوات الرئيسية استكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تعالج بين لوحة التباين في الإعداد، ويرجع ذلك إلى عدة أسباب: (أ) ويتأثر معدل نمو الكائنات الدقيقة في درجة الحرارة. يمكن أن تحدث درجة الحرارة والرطوبة ظروف مختلفة بسبب التهوية غير المستوية أو موقع الطبق في الحاضنة. (ب) والالكترونيات من الماسح الضوئي قد تسخن وتسبب التدرج في درجة الحرارة عبر سطح الماسح الضوئي. الشكل 10 يظهر تأثير هذا الانحدار الحرارة على البكتيريا العصوية المكانية، جنبا إلى جنب مع قياسات لدرجة الحرارة على سطح الماسح الضوئي قبل و بعد تنفيذ وحدة إدارة الطاقة (الخطوة 1.6). لاحظ أن هذه الوحدة قد لا يكون ضروريا لأحدث الماسحات الضوئية، وإذا تم استخدام سوى جزء من سطح الماسح الضوئي، قد تكون إدارة الطاقة لا لزوم لها. (ج) لوحات مع التعتيم مختلفة من المغذيات أجار قد تؤدي إلى مستويات مختلفة من الكشف. الشكل 11 يظهر اله التسامح لأحجام مختلفة من المغذيات آجار التي تؤدي إلى عتامة مختلفة.
تجريبيا تقنية ScanLag من السهل لتنفيذ ويتطلب فقط لوحة الكائنات الحية الدقيقة على أطباق بتري القياسية، ووضعها على سطح الماسح الضوئي. البرنامج الذي تم تطويره تسيطر على الإجراء بأكمله. ويتم الحصول على الصور تلقائيا، وتحليل الصور لتتبع المستعمرة هو أيضا التلقائي. وعلاوة على ذلك، فإن النظام يمكن زيادتها المتابعة لقياس ظروف عديدة ومختلفة في نفس الوقت. أخيرا، تعتمد الطريقة على الماسحات الضوئية المكاتب التجارية، وبالتالي، هو التكلفة المنخفضة.
ويمكن تمديد هذه التقنية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة والتي تختلف من E. القولونية K-12، ولكن عدة اعتبارات يجب أن تتم. الأولى، وتأثير المستعمرات التي تظهر في وقت مبكر على تلك في وقت لاحق لابد من تقييمها، كما هو موضح بالتفصيل في نشرة سابقة 7. لE. القولونية K-12، والكثافة القصوى من كفو لكل لوحة 200. سلالات أخرى ذات أحجام مختلفة من المستعمرات، وغيرها عبر الحديث محتملة بين المستعمرات، قد تتطلب كثافة مختلفة. الثاني، هو معايرة تحليل لوحات عتبات البرمجيات القائمة المحددة التي قد تحتاج إلى تعديل، اعتمادا على التناقض بين المتوسطة الصلبة والمستعمرات. ويمكن تمديد البرنامج أيضا لاستخراج الخصائص مستعمرة أخرى، وراء تأخر ومعدل النمو. رمز البرمجيات مفتوحة ويمكن تعديلها لاستخراج شكل مستعمرة، والسطوع، نعومة ولون.
لأنه يتم إجراء القياسات على المستعمرات التي تنشأ من الخلايا واحدة، تكشف البيانات الظواهر الجديدة التي لا يمكن قياسها بواسطة القياسات على مستوى السكان. وكشفت أهمية توزيع الوقت الضائع في وجود المضادات الحيوية. ومن المعروف أن العديد من المضادات الحيوية تكون فعالة فقط ضد الخلايا المتنامية؛ ولطالما بقيت الخلايا في مرحلة متخلفة والتي لا تنمو، فهي المواليةtected من آثار تلك المضادات الحيوية 21. عندما يتم تقييم أعداد البكتيريا الناجين في فترات زمنية أثناء العلاج بالمضادات الحيوية 15،22،23، وغالبا ما يتم كشف جزء من السكان من البكتيريا، ودعا صوامد،. في بعض الحالات، والحصانة للعلاج بالمضادات الحيوية تنبع من تأخر لفترة طويلة. باستخدام هذا الإعداد، تبين هذا التأخر، ولها توزيع غير تافهة 24 (الشكل 6) في كثير من الأحيان. هذه الطريقة تمكن أيضا استرجاع المسوخ نادرة. على سبيل المثال، بعد الطلاء السكان mutagenized، يمكن تحديد المسوخ على أساس النمط الظاهري ومعزولة مباشرة، دون التحديد. يمكن أن الإعداد أيضا رصد التفاعلات خلية خلية عن طريق قياس نمو المستعمرات بوصفها وظيفة من كثافة المستعمرات المجاورة وتحديد الظواهر مثل الاستشعار عن النصاب أو انتشار البكتيريا يحتشدون. والمعلومات التي كشفت عنها التجارب المتعددة الأبعاد في المستقبل باستخدام هذا الأسلوب يؤدي إلى توصيف أفضل من السكان الميكروبيةق والتقدم في البحوث الطبية والبيئية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Difco LB broth | BD | 240230 | |
| Petri dish 90mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Name of Equipment | |||
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution: 4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| pieces of sterile black felt cloth | custon made | approximatly 100 x100 mm | |
| white plate holders | custon made | surface size, with 6 x 99mm diameter hole | |
| Delerin rings the size of the Petri dish | custon made | inner diameter: 72 mm outer diameter: 86 mm top outer diameter: 90 mm |
Referencias
- Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).
- Penfold, W. J. On the Nature of Bacterial Lag. J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).
- Powell, E. O. Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture. J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).
- Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis. Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).
- Hertog, A., et al. Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies. PloS one. 5, (2010).
- Levin-Reisman, I., et al. Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes. Nature Methods. 7, (2010).
- Lewis, K. Persister cells. Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).
- Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).
- Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).
- Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells. Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).
- Pin, C., Baranyi, J. Single-cell and population lag times as a function of cell age. Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).
- Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations. Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner. Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells. Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).
- Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).
- Ernebjerg, M., Kishony, R. Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking. Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).
- Rotem, E., et al. Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).
- Bigger, J. The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes. Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).
- Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiol. 13, 25 (2013).
- Moyed, H. S., Bertrand, K. P. Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis. Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).
- Balaban, N. Q. Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).
