ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

この研究のために募集され、すべてのドナーが書面によるインフォームドコンセントを与え、研究はバーミンガム治験審査委員会のアラバマ大学によって承認された。 1。HUVEC最初の培養およびサブカルチャー内皮細胞基本培地から構成される完全増殖培地中、インビトロでの培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、内皮細胞増殖因子を補充した（材料のリストを参照）。 注：この研究で使用した増殖因子には：5 ng / mlのヒト組換え上皮成長因子（hEGFは）、1.0 mg / mlのヒドロコルチゾン、50 mg / mlのゲンタマイシンおよび50 ng / mlのアムホテリシン-B（GA-1000）、2 ％ウシ胎児血清（FBS）、0.5 ng / mlの血管内皮増殖因子（VEGF）、10 ng / mlのヒト線維芽細胞増殖因子-基本ヘパリン（のhFGF-B）、20 ng / mlのヒト組換えインスリン様成長因子を有する（ R 3-IGF-1）、1μg/ mlのアスコルビン酸、および22.5μg/ mlのヘパリン。完全培地37℃で最初に調製し、次いで製剤の1カ月以内に使用するために4℃で保存することができる。 細胞のためのフラスコを調製するために、完全増殖培地を、75cm 2の組織培養フラスコ（1ミリリットル/ 5cm 2で ）にした後、フラスコを加湿インキュベーター中、37℃/ 5％CO 2で平衡させて添加する少なくとも30分間。ヒトHUVECは、2,500〜5,000細胞/ cm 2の密度で、この平衡化した培養フラスコに直接播種する。 メディアが平衡化されているが、すぐに37℃の水浴中でストックHUVECのクライオバイアルを解凍する。ボルテックスすることにより、元のストレージバイアル中の細胞を分散させ、次いで2,500〜5,000細胞/ cm 2の密度を達成するために事前に平衡化HUVEC完全増殖培地を含む培養フラスコに直接加える。優しく均等に細胞を分配して、インキュベーターにフラスコを返すために、フラスコを揺する。これらの細胞は、現在、1 回目の通過を表す。 <細胞が70〜80％コンフルエントになるまで李>中2日ごとに変更する必要があります。 HUVECを現在トリプシン/ EDTAで培養フラスコから収穫することができる。培養培地を細胞から任意の残留タンパク質およびカルシウムを除去するためにPBSでリンスし、培養フラスコから吸引される。 0.25％トリプシン-EDTA溶液を添加し、光学顕微鏡により評価されるように2-6分間の細胞の剥離の中には明らかである。 90％の細胞がプレートから切り上げたとき、2×トリプシンインヒビターを等量加えることによって、トリプシン処理を停止する。細胞の収穫を容易にするために、完全な増殖培地の他の同等の量を追加します。無菌15mL遠心管に分離した細胞を移す。 室温で5分間225×gで分離した細胞を遠心分離する。上清を吸引した後、完全増殖培地を2〜3 mlの細胞を再懸濁。血球計およびトリパンブルーを用いて細胞濃度および生存率を測定。 目を利用するE研究のための細胞、再シードさらに75 cm / cmで2万個の細胞の密度で細胞と2フラスコを採取し、2.2に進みます。あるいは、細胞は、将来の研究のために、この時点で凍結することができる。細胞凍結のために、室温で5分間、225×gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を吸引除去オフし、1×10 6細胞/ mlの濃度で10％DMSOを含むFBS中で細胞ペレットを再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を、細胞凍結容器内に細胞を凍結した後凍結バイアルに移し、-80℃で保存する。 2。HUVEC層準備凍結された2 番目の通路 HUVECの使用：復活と文化。活発に増殖する細胞を用いる場合は、2.2に進みます。 37℃の水浴中で迅速にステップ1.8から2 番目の通路のHUVECを含有するクライオバイアルを解凍する。 15ミリリットル滅菌遠心管に凍結バイアルから細胞を移し、10ミリリットルの成長MEDIを追加UM。 室温で5分間、200×gで細胞を遠心し、残留DMSOを除去し、上清を吸引除去する。 完全な増殖培地で細胞ペレットを再懸濁し、75cm 2のフラスコに細胞を移す。総量約20〜25 mlに増殖培地を追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 視覚的メディアとの毎日は、2日ごとに変化し、合流のための細胞培養を調べる。通常2-4日以内に、細胞は、フローチャンバーアッセイにおける使用のための準備ができ、その時点で80〜90％コンフルエンスに達する。 （セクション5を参照）フローチャンバーで使用される培養皿を調製し、作るために、1〜10μg/ mlのフィブロネクチンmlおよび35mmの組織培養皿ピペット0.05％（w / v）のゼラチンを数回追加必ずプレート全体表面が被覆されている。タンパク質マトリックスの形成を最適化するために、少なくとも30分間、プレートを乾燥させ、過剰なフィブロネクチンとゼラチン水溶液と空気を除去。 Fibronectinゼラチン溶液を10倍まで再利用することができる。 ステップ1.5から1.7で説明したようにトリプシン-EDTAを使用して、ステップ2.2からHUVEC細胞を収穫。各コーティングされた組織培養皿に500,000細胞を播種する。各皿に2ミリリットルの増殖培地を追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 細胞はステップ2.2のように密集するまで成長させる。細胞は、視覚的に、2日ごとに培地交換を毎日点検してください。事前のフローチャンバーアッセイと、接着分子の発現をアップレギュレートし、刺激する4-6時間にわたって20 ng / mlのヒトTNF-αでのHUVECの素数。 3。精製リガンドコーティング 35mm組織培養皿の中央にマーカーやペンで直径0.5cmの円を描きます。 プレートマークされたエリア内の20μg/ mlのプロテ​​インAの20μL。タンパク質を直径0.5cmの円内全域をカバーするソリューションを広めるためにピペットチップを使用してください。それは、Dの表面に触れたり傷つけたりしないことが重要ですISH。 1時間37℃でインキュベートする。 1mlのPBS（pH8.0）でタンパク質コートプレートの3回洗浄します。 プレートに非特異的結合をブロックするマークされたエリア内のプレートに50μlの1％BSA。 4℃で2時間インキュベートステップ3.3のように、1mlのPBSでブロックし、プレート3回洗浄します。 コー​​ティング用のFc接着受容体リガンドキメラタンパク質溶液を調製する。この実験では、25μg/ mlの少なくともICAM-1/Fcキメラ溶液とPBS中の0.5μg/ mlの少なくともP-Selectin/Fcキメラ液（pH8.0）を用いた。 コー​​ト基板50μlとマークされたエリア。 4℃で一晩インキュベート料理は2日以内に使用されるべきであり、コーティングされたエリアは、乾燥させてはならない。プレート上の50μlのソリューションを維持するために必要な場合には、PBSを追加します。 4。好中球の分離（室温で実行されるすべてのステップ） インフォームドコンセントを得た後、に瀉​​血によって参加者の血液を集めるnは抗凝固採血管またはバキュテナー（EDTAまたはヘパリン）。採血後、分離前のPBSで血液1:1希釈する。 50ミリリットル遠心管にPBMCおよび好中球を分離するための2層のFicollを準備します。最初の15ミリリットル重いフィコールを（材料のリストを参照して、ρ= 1.118から1.120）追加してから、慎重に10ミリリットルを重ね重いのFicollの上に（材料のリスト、ρ= 1.077から1.080を参照）フィコールを照らす。軽フィコールと重いフィコール層の間の鋭い境界線があるはずです。最後に、注意深くフィコール層を乱すことなく光のFicollの上に希釈された血液サンプル25mlのレイヤ。 室温で30分間250×gでチューブを遠心分離する。注：これらのスピンは、遠心分離の終了時にローター減速中の細胞分離の可能性混乱を最小限に抑えるために遠心ローターブレーキはオフにする必要があります。遠心分離した後、（上から下へ）以下の層が存在している：トップ層は、プラズマfolloです光フィコール層の上にPBMC層によって結婚、いくつかの赤血球（RBC）と好中球の層がチューブの底に重フィコール層および赤血球続い軽鎖および重フィコールの間である。 収穫し、室温で10分間、225×gで50ml及び遠心分離機の最終体積にPBSを追加し、移送ピペットを用いて新たな50mlチューブへの好中球層を転写する。 遠心分離後、依然として好中球と混合したRBCがあってもよい。ダウン10ミリリットルマークに上清を吸引除去する。チューブ（または簡単な低速ボルテックス）の穏やかな撹拌によって好中球赤血球ペレットを再懸濁し、PBS 50mlで再び洗う。 二回目の洗浄後、上清を吸引除去する。夾雑赤血球を除去するには、攪拌（または短いボルテックス）による残留PBS中ペレット化した細胞を再懸濁、RBCを溶解する10秒25ミリリットルのH 2 Oを、ゆっくりと渦を追加します。 1.8％NaClを25ミリリットルを加え、すぐに混ぜる室温で10分間、225×gで遠心分離することによって。汚染したRBCは現在、白、好中球の細胞ペレットを残して溶解する必要があります。 PBSで好中球の細胞ペレットを洗浄します。 10％FBSを含むRPMI培地中で孤立した好中球を再懸濁し、血球計算板と光学顕微鏡下で細胞濃度を決定する。 完全なRPMI-10％FBS培地で500,000細胞/ mlに細胞濃度を調整。 5。フローチャンバー接着アッセイフローチャンバーを組み立てます。顕微鏡テーブルの上にコンフルエントのHUVECまたは精製された接着性受容体リガンドを含む35mmディッシュを置きます。シリンジポンプ、真空システムと平行板フローチャンバーを接続し、好中球の入力のために開いた1行のままにします。プレートの上部にフローチャンバーを挿入し、フローチャンバアセンブリ13を固定します。 （ 図1を参照してください） T接続されたコンピュータ上のビデオ録画プログラムを開始顕微鏡O。リガンド塗布領域内に十分に成長したHUVEC細胞またはフィールドとの明確なフィールドが表示されるまで、顕微鏡のフィールドとフォーカスを調整します。 シリンジポンプを用いて、RPMI培地でフローチャンバーをすすぐ。チャンバー内に気泡や好中球の入力行がないことを確認してください。 所望であれば、好中球は10分間、低用量（10 -8 M）のfMLPで下塗りしてもよい。これは異なるドナー14の間に好中球活性化の基礎レベルのマッチングを可能にする。 定義された速度（1.5ダイン/ cm 2の剪断応力がこの研究で使用されているに等しい350μlの/分の速度）でのフローチャンバーへの好中球を注入するためにシリンジポンプを使用する。ビデオを録画。好中球の接着が急速に発生する可能性があるため、4〜5分の長さのビデオは、分析のための接着事象を定量するために通常は十分です。 接着細胞は、1つのセル直径よりも小さいセルを移動させるように定義されるHUVECまたはリガンドでコーティングされた表面15,16上の5秒以内。このルールを使用して記録された映像に存在するフィールドで接着細胞の総数をカウントします。異なるドナーの好中球と同様の長さの動画を記録することによって、人は異なるドナーとの密着性を比較するために接着細胞/分を計算することができる。