يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين في الأنبوب العصبي، ولكن الهجرة للوصول إلى الأهداف المناسبة. branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية هي نموذجا مفيدا لدراسة هجرة الخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول wholemount فيفو السابقين ثقافة الماوس hindbrains جنين للتحقيق في الآليات التي تنظم الهجرة FBM.
يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين من الدماغ، ولكن في وقت لاحق الهجرة إلى وجهات جديدة للوصول إلى الأهداف المناسبة. وبالتالي فك رموز الاشارات الجزيئية التي توجه تعاوني هجرة الخلايا العصبية في المخ الجنينية من المهم أن نفهم كيف تشكل الشبكات العصبية المعقدة التي تدعم الحياة في وقت لاحق بعد الولادة. branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية في الدماغ المؤخر جنين فأر ترحيل من قسيم معيني (ص) 4 نحو caudally لتشكيل نواة الوجه تقرن في المنطقة R6-مشتقة من الدماغ المؤخر. ونحن هنا نقدم بروتوكول مفصلة لwholemount فيفو السابقين ثقافة الماوس hindbrains الجنين مناسبة للتحقيق في مسارات الإشارات التي تنظم الهجرة FBM. في هذه الطريقة، يتم تشريح hindbrains الأجنة E11.5 الماوس ومثقف في إعداد كتاب مفتوح على إدراج ثقافة خلية لمدة 24 ساعة. خلال هذا الوقت، الخلايا العصبية FBM تهاجر نحو caudally نحو R6 ويمكن أن يتعرض لعرقلة وظيفة الأجسام المضادة وmolecul الصغيرةوفاق في وسائل الإعلام أو الثقافة أو الخرز الهيبارين محملة البروتينات المؤتلف لدراسة الأدوار لمسارات الإشارات المتورطين في توجيه هجرة الخلايا العصبية.
يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين من الدماغ، ولكن في وقت لاحق الهجرة إلى وجهات جديدة للوصول إلى المناطق المستهدفة المناسبة التي تقع على مسافة كبيرة. في الموضع الصحيح من أجسام الخلايا العصبية في الأماكن المناسبة على طول محاور ظهراني بطني والأمامي الخلفي من الدماغ النامية أمر ضروري لالأسلاك الصحيح والبقاء، وظيفة هذه الخلايا العصبية بعد المرحلة المهاجرة 1-4. على غرار الآليات الجزيئية التي تتحكم في محوار 5-7 التوجيه، ويعتقد أن مجموعات اندماجي من العظة جذابة ومثيرة للاشمئزاز لتوجيه الخلايا العصبية المهاجرة 1،8. ولكن نظرا لتفاعلات أنواع خلايا متعددة، وإشارات التحكم هجرة الخلايا العصبية وقد تم دراسة على نطاق واسع أقل من تلك التي تشارك في التوجيه محور عصبي، والتي يمكن دراستها خلية مستقلة. وقد استخدم الدماغ المؤخر النامية من الفقاريات في العديد من الدراسات الحديثة لفهم الآليات الجزيئية والخلويةالهجرة العصبية، على سبيل المثال في الفرخ، والماوس، والزرد 1-4،9. هذا الجهاز يحتوي على العديد من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، بما في ذلك عدة أنواع فرعية من الخلايا العصبية الحركية وprecerebellar 5،7،10،11.
يولدون motorneuron الدماغ المؤخر في منطقة البطين بالقرب من floorplate، وأنها تفرق في مجموعات فرعية محددة وفقا لقسيم معيني منشئهم 1،12. يتم إنشاء branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية في قسيم معيني (ص) 4 في الدماغ المؤخر وتوسيع محاور بهم ظهريا من خلال نقطة خروج R4 في القوس الخيشومي الثاني ليعصب عضلات الوجه 2،9،13. الخلايا العصبية FBM من الزرد والفئران توفير نماذج ممتازة لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية للهجرة الخلايا العصبية في العملية التي تصور بسهولة، لأن هذه الخلايا العصبية نقل من بتكاثر somata في عملية spatiotemporally محددة جيدا. في الفئران، والخلايا العصبية FBM ترحيل كاو الأولىتوانى عن طريق R5 ثم كلا نحو caudally والبطني للوصول إلى موقفهم النهائي على الجانب حنوني من الدماغ المؤخر في إقليم R6، حيث أنها تشكل نواة الاقتران من العصب القحفي VIIth (VIIn) 10،11،14. في الزرد، الخلايا العصبية FBM تهاجر البداية البطني ومن ثم تغيير الاتجاه في حدود R4-R5 لمواصلة ترحيل نحو السطح حنوني في laminin بطريقة تعتمد على 4،12،15،16. هذه الهجرة العائدات على مدى فترة من عدة أيام في التنمية ويمكن تقسيمها إلى مراحل الهجرة عرضية والشعاعية، مما يتيح تحديد الجزيئات التي تتوسط هذه العمليات مميزة اثنين. في المقابل، تبقى الخلايا العصبية FBM من فرخ الدماغ المؤخر الجنينية في R4 3،13،17-19.
أثناء هجرتها، ويمكن تحديد الخلايا العصبية FBM، مثل أنواع أخرى أو الخلايا العصبية الحركية، من خلال التعبير عنها من homoeodomain النسخ عامل جزيرة 1 (ISL1) 14. وبالتالي، مصنعونemount المناعي تلطيخ أو التهجين في الموقع لهذه العلامة في مراحل تنموية مختلفة يكشف عن تيار المهاجرة متميزة من FBM somata تمتد من R4 لR6 في الزرد أو الماوس 4،15،16. علاوة على ذلك، للصحفيين الفلورسنت المعدلة وراثيا مثل ISL1-GFP استخدمت كأدوات مناسبة لتصور هجرة الخلايا العصبية FBM في الزرد 3،17-19. بالإضافة إلى ملاءمتها للتصوير، درسوا العديد من المحققين هجرة الخلايا العصبية FBM في تطوير الزرد، لأن الأجنة فراغهم المعيشة يمكن التلاعب بها بسهولة مع تقنيات زرع الخلايا والمركبات الدوائية تطبيقها مباشرة على مياه الحوض. في المقابل، يطور المغلقة الجنين الماوس في الرحم، مما يحول دون غرس الخرز تحمل العظة توجيه أو إدارة الأجسام المضادة عرقلة وظيفة التي لا عبور حاجز المشيمة. وعلاوة على ذلك، قد المركبات الدوائية تدار على الأم الحامل لها الامم المتحدةالآثار الجانبية المطلوب الذي يمكن أن يضعف بشكل غير مباشر مرحلة التطور الجنيني. التحايل على هذا التحديد، قمنا بتطوير طريقة فيفو السابقين الثقافة لكامل الدماغ المؤخر الماوس متوافق مع الهجرة FBM الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة لمدة 24 ساعة بعد explanting 7،16. هذا الأسلوب يسمح التلاعب الدوائية سهلة، زرع من الخرز تحمل العظة توجيه أو إدارة الأجسام المضادة عرقلة وظيفة ويمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة هجرة فرعية الخلايا العصبية الأخرى في الدماغ المؤخر في مراحل تنموية مختلفة.
يصف هذا البروتوكول ثقافة wholemount من hindbrains E11.5 الماوس في نظام transwell لدراسة هجرة الخلايا العصبية FBM. هذا البروتوكول يسمح motorneurons الماوس الدماغ المؤخر إلى أن تبقى على قيد الحياة والهجرة لمدة 24 ساعة، مما يتيح التلاعب فيفو السابقين. هذه الطريقة لها العديد من المزايا التجريبية للمحققين الذين يسعون إلى تحديد الآليات الجزيئية والخلوية للهجرة الخلايا العصبية. في حين المقايسات الهجرة التقليدية ازدراع قطع صغيرة الأنسجة العصبية في مصفوفة على أطباق الثقافة وتمكين المراقبة من الخلايا العصبية الفردية كما أنها تستجيب للمؤثرات الخارجية، وميزة كبيرة للمقايسة transwell هو مدى ملاءمتها لمعالجة الخلايا العصبية المهاجرة ضمن بيئة الجهاز المضيف، وبالتالي أكثر سياق الفسيولوجية. الأهم من ذلك، مواد يمكن تطبيقها بسهولة إلى الدماغ المؤخر إإكسبلنتس فيفو السابقين لاختبار تأثيرها على هجرة الخلايا العصبية، التحايل على الآثار الجانبية المحتملة المرتبطة administeترن هذه المواد إلى ماوس الحوامل. أخيرا، يسمح للنموذج الجسم الحي السابقين أيضا اختبار المواد التي لا عبور حاجز المشيمة، مثل الأجسام المضادة حجب وظيفة. نظرا لهذه المزايا، يقدم فيفو السابقين الدماغ المؤخر الثقافة بديل وطريقة مكملة لاستخدام الأجنة الزرد، والتي يمكن علاجها مع الماء جزيئات صغيرة قابلة للذوبان في الماء الحوض، أو في الرحم التثقيب الكهربائي من العقول الجنينية، الأمر الذي يتطلب استخدام المتخصصة معدات وأكثر صعوبة لإتقان هذه التقنية من الثقافة الموصوفة هنا. ميزة أخرى لبروتوكول الموصوفة هنا هو قابليته لزرع حبات غارقة في المؤتلف البروتين أو الكواشف الأخرى، وبالتالي السماح للتطبيق طريقة الجنينية القياسية وضعت لمعالجة الأجنة فرخ لنموذج الفأر من هجرة الخلايا العصبية. على وجه الخصوص، فيفو السابقين نموذج الثقافة يمكن تطبيقها على hindbrains من الفئران المعدلة وراثيا defecTIVE في جزيئات محددة متورطة في هجرة الخلايا العصبية، مثل النمو أو عامل التوجيه المستقبلات، وجنبا إلى جنب مع يزرع حبة لاختبار إذا فقدت القدرة على الاستجابة للبروابط. بالإضافة إلى التلاعب الدوائية، ويمكن أيضا أن تتكيف على فيفو السابقين الثقافة بروتوكول ل electroporate ناقلات التعبير التي يمكن التلاعب التعبير عن الجينات في المصالح؛ الأساليب المناسبة ل electroporation سبق وصفها 22،23. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول لتصور هجرة الخلايا العصبية بواسطة الوقت الفاصل بين المجهري في إإكسبلنتس الدماغ المؤخر من الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على الخلايا العصبية FBM fluorescently المسمى، على سبيل المثال، لجنة المساواة العرقية Isl1؛ Rosa26Yfp 21. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة أنواع أخرى من الخلايا العصبية المهاجرة في الدماغ المؤخر، مثل تلك التي تشكل الزيتون السفلي، على الرغم من أن هذا من شأنه أن يتطلب استخدام hindbrains في المراحل الجنينية وكبار السن قد تتطلب الثقافة لمدة تصل إلى 48 ساعة، اعتمادا على الجدوى العصبية <em> فيفو السابقين.
الخطوات الحاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
لنجاح هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان أن يتم جمع الأجنة في وقت مبكر يوم E11.5 اليوم، أقرب إلى E11.25، عندما FBM الخلايا العصبية الهجرة قد بدأت للتو. ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن دائما للقبض على الأجنة في هذه المرحلة التنموية بسبب تقلب التزاوج الطبيعي من الفئران، وفقا لذلك، قد يكون هناك بعض التباين في توسيع نطاق الهجرة FBM بين تجارب مختلفة. ويمكن أيضا أن يلاحظ التباين في الهجرة FBM إذا لم يتم الانتهاء من التجربة ضمن الإطار الزمني المعين، حوالي 3 ساعة، كما يمكن أن يرى في الشكل 3E. نسيج الدماغ المؤخر من E11.25 أجنة الفئران حساسة. عند تشريح وطوال الإجراء يزدرع، فمن المهم أن لا تمزق الأنسجة الدماغ المؤخر في مجالات من R4-R6 حيث توجد الخلايا العصبية FBM. نظرا لطبيعة حساسة من ديسعملية ection، ولأن السرعة التي يتم وضعها hindbrains في الثقافة تؤثر النتيجة، قد يستغرق هذا الإجراء بضع الممارسة يعمل لسيده، ولا سيما قبل أن يتم استخدام العينات الثمينة أو الكواشف. أخيرا، من المهم أن يتم وضع الأنسجة في الدماغ المؤخر تكوين كتاب مفتوح على إدراج الثقافة، للطي من الأنسجة الدماغ المؤخر خلال الثقافة ومنع الهجرة FBM العادي (انظر الشكل 3F).
The authors have nothing to disclose.
معتمد من قبل MT دكتوراه studentship [المرجع. 092839/Z/10/Z] وCR من قبل جائزة الباحث جديد [المرجع. 095623/Z/11/Z] من ويلكوم ترست.
Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
Cell culture plates, 12 well | Thermo Scientific | 150628 | |
Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Glucose | VWR | 101174Y | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
Recombinant human VEGF165 | R&D systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |