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Quimica

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

Published: April 03, 2014
doi:
10.3791/51385
, ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Bern

Summary

ここに記載されているプロトコルは、修飾されたヌクレオシド三リン酸に至る複雑なルートのように数々の障害を説明し、要約するすることを目指しています。結果的に、このプロトコルは、これらの活性化ビルディングブロックの合成と実用化のための彼らの可用性の両方を容易にします。

Abstract

化学官能基の導入のための伝統的な戦略は、新生鎖に適切に修飾されたホスホルアミダイト前駆体を付加することにより、固相合成の使用である。しかし、合成中に使用される条件と、むしろ短い配列への制限は、この方法論の適用を妨げる。一方、修飾されたヌクレオシド三リン酸は、核酸に多数の官能基の導入のために軽度の実用的な用途の幅広いパレットの修飾された核酸の使用への道を開く戦略を採用されている構成要素を活性化さこのようなリボザイムおよびDNAザイムの機能的タギングおよび生成など。主要な課題の一つは、これらのヌクレオシド類似体の単離および特徴付けをもたらす方法論の複雑さにある。

このビデオの記事では、我々はテサロニケの合成のための詳細なプロトコルを提示Eリン（III）ベースの試薬を用いて類似体を変更しました。また、それらの生化学的特性評価のための手順は、プライマー伸長反応とのTdTテーリング重合に特別な重点を置いて、漏らしている。この詳細なプロトコルは、修正されたdNTPのクラフトや化学生物学におけるそれらのさらなる使用のために使用されるであろう。

Introduction

5'-ヌクレオシド三リン酸（（D）のNTP）は、エネルギーのユニバーサル為替であることから細胞代謝の調節因子に至るまで無数のプロセスと機能に関与している重要な生体分子のクラスを表す。これらの基本的な生物学的変換での彼らの役割に加えて、これらの変性の対応は、オリゴヌクレオチドに官能基を導入するための汎用性とマイルドなプラットフォームとしてうまく通常1,2に適用され、自動化固相合成を補完する方法論を進めてきた。実際に、（d）には、NTPをRNAのための基質として作用することができ、DNAポリメラーゼが3に 、アミノ酸4-13、ボロン酸14,15を含む官能基の富に対するnornbornene 16、ダイヤモンド状の残基17、側鎖設け有機触媒18、胆汁酸19、さらには20オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに導入することができる。

_content ">核酸の機能化のための便利なベクトルを表す以外に、修飾dNTPは、SELEXと変更された触媒核酸21〜30と、様々な実用的なアプリケーション10のためのアプタマーを生成するためのin vitro選択の他の関連するコンビナトリアル法に従事することができます31-36。修飾dNTPの重合により導入される追加の側鎖は、選択実験の間探求および核酸37のかなり乏しい官能性兵器を補完することができる化学容量を増加させると考えられているが、これらにもかかわらず魅力的な特性と、合成および分析方法の両方の開発で行われた最近の進歩、ない普遍的に適用し、高収量の手順では、修飾されたヌクレオシド三リン酸2,38のクラフティングのために存在しています。

この議定書の目的は、（場合によっては）複雑な手順をリードするTに光を当てることですこれらの活性化ビルディングブロック（ 図1B）の合成および生化学的特徴O。特に重点は頻繁に見つけることは困難であるか、実験のセクションには存在しないが、純粋な（D）のNTP（ 図1）を単離に至る合成経路が正常に完了するためにまだ非常に重要であるすべての合成の詳細について説明する。

Protocol

1。修飾ヌクレオシド三リン酸の合成選択された合成法は、この方法は一般的に信頼性が高く、非常に少数の副生成物（ 図1A）39につながるため、ルートヴィヒとエクスタインによって開発された手順に従います。 一晩真空下で乾燥した後、無水ピリジン（2ミリリットル）で2回、適切に3'-OAcで保護されたヌクレオシド（通常は0.1 mmol）のCoe…

Representative Results

彼らは核酸41への官能基の広大な配列の容易な導入を可能にするので修飾されたヌクレオシド三リン酸は合成標的を魅惑的なされています。しかしながら、これらの活性化されたビルディングブロックの単離および特徴は、しばしば困難であることが判明している。従って、本明細書に示した結果は、上述の合成および生化学的手順内の様々な工程（ 図1B）を追従する手?…

Discussion

核酸への変更を含めることは、アンチセンスおよびアンチジーン剤の開発42,43、標識及びオリゴヌクレオチド41の機能的なタグ付けを含む数多くの実用的なアプリケーションのために重要である、と遺伝アルファベット44〜46を拡張するための努力において。化学的改変及び官能基は、通常、標準および自動固相合成プロトコルを適用することにより核酸中に導入され?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、スイス国立科学財団（助成N°PZ00P2_126430 / 1およびPZ00P2_144595）によってサポートされていました。教授C.ロイマンは感謝ラボスペースと設備を提供するためだけでなく、彼の一定のサポートのために認められている。さんスークネヒトは実りある議論のために認められている。

Materials

tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo–) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.
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Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates – From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).
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