Здесь мы показываем, использование флуоресцентного красителя Alexa, соединенного с α-бунгаротоксина для измерения ГАМК поверхность локализации рецептора и эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Благодаря использованию конструкций, несущих короткий внеклеточный тег, который связывается α-Бунгаротоксин, анализ плазмы мембранного белка торговли эндоцитоза может быть достигнута.
Становится все более очевидным, что рецепторы нейротрансмиттеров, включая рецепторы ионотропного ГАМК A (GABAAR), выставочная динамичной торговли и клеточной поверхности мобильности 1-7. Для изучения рецепторов локализацию поверхности клеток и эндоцитоз, Техника, описанная здесь сочетает в себе использование флуоресцентного α-бунгаротоксина с клетки, экспрессирующие конструкции, содержащие α-бунгаротоксина (BGT) сайта связывания (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) основан на α-субъединицы мышечной никотинового рецептора ацетилхолина, который связывается Bgt с высоким сродством 8,9. Включение участка BBS позволяет поверхности локализацию и измерения вставки или удаления рецептора с применением флуоресцентного экзогенный БГТ, как описано ранее в отслеживании GABAA и метаботропного GABAB рецепторов 2,10. В дополнение к BBS сайта, мы вставили рН-чувствительные GFP (pHGFP 11) между аминокислотами 4 и 5 зрелой субъединицы GABAAR стандартными мolecular биология и ПЦР клонирования стратегии (см. рисунок 1) 12. BBS является 3 'рН-чувствительного GFP репортер, разделенных 13-амино аланин кислота / пролина линкера. За торговлю исследования, описанные в данной публикации, основанные на фиксированных образцов, pHGFP служит репортер от общего числа отмеченных GABAAR уровни субъединицы белка, что позволяет нормализация BGT помечены население рецептора к общей численности населения рецепторов. Это сводит к минимуму клетки к клетке изменчивость сигнала BGT окрашивания в результате высокой или более низкой базовой экспрессии меченых GABAAR субъединиц. Кроме того тег pHGFP позволяет легко идентифицировать построить экспрессирующих клеток для живых или фиксированных экспериментов визуализации.
Использование флуоресцентной сочетании α-бунгаротоксина учиться рецептора локализацию и динамику был впервые в исследованиях никотиновой рецептора ацетилхолина 13-15 эндогенного цели токсина. Впоследствии введение минимальной BGT связывания пептида (BBS) был использован для изучения торговли обеих возбуждающих и тормозных лиганд-ионных каналов и G белком рецепторов 2,10,16-21. Эта техника BBS основе обеспечивает преимущества с другими подходами, используемых для исследований торговли людьми, такие как методы поверхность биотинилирования, маркировки антител живых клеток с антителами к внеклеточных эпитопов и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Во поверхности клетки биотинилирования свободные амины ковалентно модифицированный, с потенциалом, чтобы повлиять на клеточную активность. Исследования, основанные антитела часто мешает поверхностного антигена кластеризации или укупорки, которая может изменить события с торговлей людьми. В связи с этапа отбелки на FRAP сtudies, важной задачей является повреждения основной клеточную структуру. Дополнительным преимуществом является то, что BBS отмеченных конструкции также могут быть использованы для биохимических методик с оборота рецептора в сочетании биотин-Бунгаротоксин ослов. Этот метод легко применим к клеточных линий и первичных клеток. Для использования в клетках, которые экспрессируют никотиновую ацетилхолин (Nachr) рецепторов, антагонист тубокурарин нАХР должны использоваться на протяжении всего протокола, как указано. Выполнение простой поверхности BGT маркировки (эквивалент Т = 0 момент времени для протокола эндоцитоза) на нетрансфицированных клеток в отсутствие тубокурарина, должны представить доказательства эндогенного Nachr.
Важным фактором для использования этого метода является целесообразным введение в BBS так, что он присутствует на внеклеточный месте, когда представляющий интерес белок доставляется в плазматической мембране. Например, N-концевые домены из GABAAR субъединиц проживают в везикулярного просвета во торговлей людьмиговли и стать внеклеточного рецептора после введения в плазматической мембране, что позволяет конкретной маркировки рецепторами клеточной поверхности и оценка их удаления с поверхности клеток с помощью эндоцитотических событий. Ранее нами было показано, что добавление GFP, Myc, или BBS эпитопов в этой области GABAAR субъединиц функционально молчание. Стандартные элементы должны быть выполнены, чтобы гарантировать, что меченый белок экспрессируется на том же уровне, чтобы без метки конструкции, что она соответствующим образом локализованы, и что он не влияет на функцию рецептора. Эта характеристика трансфектированных конструкций также поможет в устранении неполадок проблем избыточной экспрессии.
В основе BBS неподвижные и живые Методы, описанные здесь, могут использоваться для отслеживания рецептор или другой плазматической мембраны с торговлей белка в клеточных линиях, нейронах и других первичных клеток. Этот метод был успешно использован для изучения вставки мембраны и удал?…
The authors have nothing to disclose.
Поддержку оказали запуска-фондов от биологического факультета фармакологии и химической в университете Питтсбурга школа медицины. Подтверждение Иакова членов лаборатории, которые внесли свой вклад в видео представления: Николай Graff.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
(+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
mounting medium | DAKO | cS703 | |
DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 |