Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren
Summary
Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.
Abstract
Die Hirnrinde von mehreren Schichten und viele verschiedene Zelltypen, die zusammen als ein Netzwerk für viele höhere kognitive Funktionen einschließlich Entscheidungen, sensorischen geführte Verhalten oder Speicher verantwortlich ist. Um zu verstehen, wie solche komplizierten neuronalen Netzwerken erfüllt die Aufgaben, ist ein wichtiger Schritt, um die Funktion (oder elektrische Aktivität) der einzelnen Zelltypen innerhalb des Netzes zu bestimmen, wenn das Tier bevorzugt ist die Durchführung einer entsprechenden kognitiven Aufgabe. Zusätzlich ist es ebenso wichtig, die anatomische Struktur des Netzwerks und der morphologischen Architektur der einzelnen Neuronen zu ermöglichen Reverse Engineering des kortikalen Netzwerks zu bestimmen. Technische Durchbrüche heute ermöglichen die Aufnahme Zellaktivität bei wachen, sich verhaltenden Tier mit der wertvollen Möglichkeit, Post-hoc-Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen. Hier zeigen wir die juxtasomal Biocytin Markierungstechnik, die Aufzeichnungsaktion Potentiometer beinhaltetal Spick in der extrazellulären (oder lose-Patch)-Konfiguration mit herkömmlichen Patch-Pipetten. Die juxtasomal Aufnahmekonfiguration ist relativ stabil und zutreffend über Verhaltensbedingungen, einschließlich betäubt, betäubt, wach Kopf befestigt, und auch in der frei beweglichen Tier. Somit ermöglicht diese Methode die Verknüpfung Zelltyp-spezifische Aktionspotential Spick während das Verhalten der Tiere, um die Rekonstruktion der einzelnen Nervenzellen und letztlich der gesamten kortikalen Mikroschalt. In diesem Video-Manuskript, zeigen wir, wie einzelne Nervenzellen im juxtasomal Konfiguration kann mit Biocytin in der Urethan-narkotisierten Ratten für Post-hoc-Identifikation und morphologische Rekonstruktion gekennzeichnet werden.
Introduction
Neuronale Netzwerke bestehen aus mehreren Zelltypen, dadurch gekennzeichnet, hochspezifische morphologische und physiologische Eigenschaften 1-7. Als eine Folge einzelner Zelltypen führen spezialisierte Aufgaben im Netzwerk (siehe beispielsweise Gentet et al. 8 und Burgalossi et al. 9). Wir sind erst am Anfang, um die Zelltyp-spezifische Funktionen in neuronalen Netzwerken zu verstehen und ist immer noch viel zu entdecken. Zu diesem Zweck sind viele Labors experimentelle Ansätze anwenden, die die Analyse von morphologischen Eigenschaften des gleichen neuronalen Population, aus der physiologischen Parameter wurden erhalten, 1,10-15 ermöglichen. Hier zeigen wir die juxtasomal Markierungstechnik 16,17, die elektrophysiologischen Ableitungen geht mit herkömmlichen Patch-Pipetten in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration in Kombination mit der Elektroporation aufgezeichnet Neuron mit Biocytin. Diegroße Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die nicht-invasive Natur sorgt dafür, dass Aktionspotential Spicken von einzelnen Neuronen ohne Veränderung (zB Dialyse) den intrazellulären Inhalt der Zelle aufgezeichnet. Gefolgt durch Elektroporation bietet die juxtasomal Ansatz die Möglichkeit, Post-hoc-Zell-Identifikation und Rekonstruktion der Funktion (Physiologie), um die Struktur (Morphologie) zu verknüpfen. Typischerweise beinhaltet morphologische Rekonstruktion Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Morphologie, die Quantifizierung der Wirbelsäule und / oder bouton Dichten oder auch Rekonstruktion von neuronalen Morphologie im Nanometerauflösung mittels Elektronenmikroskopie erweitert werden kann. Die juxtasomal Aufzeichnungstechnik kann für die in vivo-Aufnahmen von verschiedenen Zelltypen in kortikalen Schichten oder subkortikale Bereiche in einer Reihe von Arten verwendet werden, obwohl die meisten Studien haben die Technik in kleine Nagetiere wie Mäuse oder Ratten angewendet. Unsere Forschung ist auf die Aufnahme und Kennzeichnung Neuronen konzentriertaus Ratten primären somatosensorischen Kortex (S1) und beinhaltet visuelle Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen 18, dendritische Rekonstruktionen in Kombination mit präzise Erfassung in einem standardisierten Referenzrahmen Reverse Engineering kortikaler Netzwerke 4,19 und detaillierte Rekonstruktion der axonalen Architektur zur Charakterisierung Zelltyp-spezifische lokale und langfristige Projektion richtet 20.
Im Vergleich zu alternativen In-vivo-Aufnahmetechniken (intrazelluläre oder ganze Zellen), sind juxtasomal Aufnahmen relativ stabil und können daher über Verhaltenszustände einschließlich betäubt 21,22 angewendet werden, sediert 14, wach kopffesten 23 oder sogar frei beweglichen Tieren 9 . Hier zeigen wir juxtasomal Kennzeichnung S1 eines Urethan-narkotisierten Ratten, obwohl wir betonen die allgemeine Anwendbarkeit dieser Technik auf viele Vorbereitungen der Wahl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die juxtasomal Verfahren ermöglicht die Aufnahme in vivo Aktionspotential Spicken von einzelnen Einheiten über Verhaltensbedingungen (narkotisiert, wach Kopf-fest oder frei zu bewegen) mit der Option der Biocytin-Beschriftung der aufgezeichneten Neuron für Post-hoc-Zelltyp Klassifizierung und / oder 3D-Rekonstruktion. Der große Vorteil ist, um physiologische Parameter in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration zu erhalten, noch in der Lage, das Neuron intrazellulär mit Biocytin <s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Profs danken. Huibert Mansvelder und Bert Sakmann für umfangreiche Unterstützung, Dr. Marcel Oberländer für fruchtbare Diskussionen und die Bereitstellung neuronalen Tracing und Brendan Lodder für technische Unterstützung. Die Daten wurden mit Hilfe des ntrode VI für LabView, großzügig von Bruno R. (Columbia Univ., NY, USA) zur Verfügung gestellt erworben. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und des Bernstein Zentrums für Computational Neuroscience, Tübingen unterstützt (vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Zentrum für Neurogenomik und Kognitionsforschung (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), die Finanzierung zu CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 und ENC-Network # p3-c3) und der VU University Amsterdam.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
Referencias
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