Juxtasomal Biocytin وصفها لدراسة بنية وظيفة علاقة فردية القشرية الخلايا العصبية
Summary
لفهم بنية الشبكات العصبية، وتوصيف وظيفي والمورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية هو ضرورة. هنا، علينا أن نظهر وضع العلامات juxtasomal biocytin، والذي يسمح التسجيلات الكهربية في تكوين الخلية، ولكن الحفاظ على القدرة على تسمية الخلايا العصبية داخل الخلية لإعادة الإعمار آخر مخصص للشجيري والهندسة المعمارية محور عصبي.
Abstract
تتميز قشرة الدماغ بواسطة طبقات متعددة وكثيرة متميزة الخلية الأنواع التي معا كشبكة هي المسؤولة عن العديد من الوظائف المعرفية بما في ذلك صنع القرار العليا، والسلوك الحسي موجهة أو الذاكرة. لفهم كيف يمكن لهذه الشبكات العصبية المعقدة أداء مثل هذه المهام، خطوة حاسمة في تحديد وظيفة (أو النشاط الكهربائي) من أنواع الخلايا الفردية داخل الشبكة، تفضيلي عند الحيوان هو أداء مهمة المعرفية ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أيضا لتحديد بنية التشريحية للشبكة والبنية المورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية للسماح الهندسة العكسية شبكة القشرية. اختراقات التقنية المتاحة اليوم تسمح تسجيل النشاط الخلوي في اليقظة، تتصرف الحيوانات مع خيار قيمة من آخر مخصص تحديد الخلايا العصبية المسجلة. هنا، علينا أن نظهر تقنية وضع العلامات juxtasomal biocytin، الذي ينطوي على إجراءات تسجيل potentiآل ارتفاعه في تكوين خارج الخلية (أو فضفاضة التصحيح) باستخدام ماصات التصحيح التقليدية. تكوين تسجيل juxtasomal مستقرة نسبيا وقابلة للتطبيق في جميع أنحاء الظروف السلوكية، بما في ذلك تخدير، مخدرا، مستيقظا الثابتة الرأس، وحتى في الحيوان يتحرك بحرية. وهكذا، وهذه الطريقة تسمح ربط الخلايا من نوع إجراءات محددة ارتفاعه المحتملة خلال سلوك الحيوان لإعادة بناء الخلايا العصبية الفردية، وفي نهاية المطاف، والمتناهية الصغر القشرية بأكملها. في هذه المخطوطة الفيديو، وتبين لنا كيف يمكن أن توصف الخلايا العصبية الفردية في تكوين juxtasomal مع biocytin في الفئران مخدرة يوريثان لتحديد آخر مخصص وإعادة الإعمار المورفولوجية.
Introduction
تتكون الشبكات العصبية من أنواع خلايا متعددة، وتتميز خصائص المورفولوجية والفسيولوجية محددة للغاية 1-7. نتيجة لذلك، أنواع الخلايا الفردية أداء المهام المتخصصة داخل الشبكة (انظر على سبيل المثال Gentet وآخرون. 8 وBurgalossi وآخرون. 9). نحن ليست سوى بداية لفهم وظائف محددة نوع الخلية عبر الشبكات العصبية والكثير لا يزال يتعين اكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية، العديد من المعامل وتنفيذ نهج التجريبية التي تسمح للتحليل الخصائص المورفولوجية من نفس السكان من الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها المعلمات الفسيولوجية 1،10-15. هنا، ونحن لشرح وضع العلامات juxtasomal تقنية 16،17 الذي ينطوي التسجيلات الكهربية باستخدام ماصات التصحيح التقليدية في التكوين (وبالتالي موسع) خارج الخلية في تركيبة مع التثقيب الكهربائي من الخلايا العصبية المسجلة مع biocytin. الالميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن طبيعة موسع يضمن أن العمل ارتفاعه المحتملة من الخلايا العصبية الفردية يتم تسجيلها دون تغيير (على سبيل المثال dialyzing) محتوى الخلايا من الخلية. تليها التثقيب الكهربائي، ونهج juxtasomal يوفر خيار آخر تحديد الخلية المخصصة وإعادة الإعمار لربط وظيفة (وظائف الأعضاء) لهيكل (التشكل). عادة والتعمير المورفولوجية ينطوي على إعادة بناء التشكل شجيري ومحور عصبي والتي يمكن أن تمتد إلى العمود الفقري الكمي و / أو حبة الكثافة أو حتى إعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية في القرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني. تقنية تسجيل juxtasomal يمكن استخدامها لفي الجسم الحي تسجيلات لمختلف أنواع الخلايا عبر الطبقات القشرية أو في المناطق شبه القشرية في مجموعة من الأنواع، على الرغم من أن معظم الدراسات قد طبقت هذه التقنية في القوارض الصغيرة مثل الفئران أو الجرذان. وتركز أبحاثنا على تسجيل ووصفها الخلايا العصبيةمن الفئران القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) وينطوي على تحديد الخلايا العصبية البصرية سجلت 18، شجيري اعادة البناء في تركيبة مع تسجيل دقيق في إطار مرجعية موحدة لعكس مهندس شبكات القشرية 4،19 وإعادة الإعمار مفصلة العمارة محور عصبي لوصف نوع محدد خلية محلية والإسقاط طويل المدى يستهدف 20.
مقارنة في الجسم الحي تقنيات التسجيل بديلة (الخلايا أو خلية كاملة)، والتسجيلات juxtasomal مستقرة نسبيا، وبالتالي يمكن تطبيقها في جميع أنحاء دول السلوكية بما في ذلك تخدير 21،22، مخدرا 14، 23 مستيقظا الحيوانات الثابتة الرأس، أو التحرك بحرية، وحتى 9 . هنا، وتبين لنا وضع العلامات juxtasomal في S1 من الفئران تخدير يوريثان، على الرغم من أننا نشدد على تطبيق العام لهذه التقنية إلى العديد من الأعمال التحضيرية في الاختيار.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح أسلوب juxtasomal تسجيل في العمل فيفو ارتفاعه المحتملة من وحدات واحدة عبر الظروف السلوكية (تخدير، مستيقظا أو بحرية التحرك الثابت الرأس) مع خيار من الخلايا العصبية المسجلة لآخر مخصص نوع من الخلايا تصنيف و / أو إعادة الإعمار 3D-وصفها biocytin. والميزة الرئيسية …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الأستاذان. Huibert Mansvelder وبيرت Sakmann للحصول على دعم واسع النطاق، والدكتور مارسيل Oberlaender لإجراء مناقشات مثمرة وتوفير تتبع الخلايا العصبية، وبريندان ودر للحصول على المساعدة الفنية. تم الحصول على البيانات باستخدام ntrode السادس لابفيف، قدمت بسخاء من قبل R. برونو (جامعة كولومبيا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). وأيد هذا البحث من قبل جمعية ماكس بلانك ومركز العلوم العصبية الحاسوبية لبرنشتاين، توبنغن (بتمويل من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF؛ FKZ: 01GQ1002)) (RTN)، مركز البحوث وNeurogenomics المعرفي (CNCR) ، علم الأعصاب في الحرم الجامعي أمستردام (NCA)، التمويل لCPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 وENC-P3-# شبكة C3) وVU جامعة أمستردام.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
Referencias
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
