에서 전기 생리학 기록<em> 초파리</em> Labellar는 Sensilla 맛
Summary
이 프로토콜은 초파리에서 labellar 맛 뉴런에 의해 트리거되는 액션 잠재적 인 반응의 세포 녹음을 설명합니다.
Abstract
곤충의 주변 맛 응답 강력 전기 생리학 기술을 조사 할 수 있습니다. 여기에서 설명하는 방법은 연구자가 곤충 신경계는 환경에서 맛의 자극에서받는 감각 입력을 반영, 직접 정량적으로 미각 반응을 측정 할 수 있습니다. 이 프로토콜은이 기술을 수행하는 모든 주요 단계를 설명합니다. 등 필요한 장비 및 녹음에 적합한 환경의 선택과 같은 전기 생리학 장비를 조립에서 중요한 단계가 묘사되어있다. 우리는 또한 적절한 참조 및 기록 전극을 만들어 녹음을 준비하는 방법에 대해 설명하고, tastant 솔루션을 제공합니다. 우리는 상세히 코를 고정화하기 위해 플라이로 유리 기준 전극을 삽입하여 곤충의 제조에 사용되는 방법을 설명한다. 우리는 설탕과 쓴 화합물에 대한 응답으로 맛의 신경 세포에 의해 해고 전기 자극의 흔적을 보여줍니다. 프로토콜의 측면들은 t 아르으로 말하면 도전과 우리는 신호 또는 시스템의 과도한 소음의 부족, 그리고 잠재적 인 솔루션으로 발생할 수있는 몇 가지 일반적인 기술 과제의 광범위한 설명을 포함. 기술은 시간적으로 복잡한 자극을 전달 배달을 자극 직전에 발사 배경을 관찰하거나, 편리 불용성 맛 화합물을 사용할 수없는 등의 제한 사항이 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, (프로토콜에서 참조하는 약간의 변동 사항을 포함한다)이 기술은 화합물을 맛 초파리 신경 세포의 반응을 기록 광범위하게 허용 절차 표준입니다.
Introduction
맛의 감각은 벌레가 녹는 화학 물질의 광대 한 범위를 감지 할 수 있으며 영양 물질의 수용에 중요한 역할, 또는 유해 독성 하나의 거절을한다. 맛도 페로몬 1-5의 검출을 통해, 친구 선택에 역할을하는 것으로 생각된다. 이 중요하고 다양한 기능 감각 시스템은 환경 신호를 관련 행동 출력으로 변환하는 방법에 곤충 맛 시스템 조사의 강력한 대상 만들었습니다.
초파리의 맛 시스템의 기본 단위는 맛 머리, 또는 sensillum입니다. 분자는 팁 2,6에서 기공을 통해 sensillum을 입력합니다. Sensilla는 labellum, 다리, 날개 마진 및 인두 6에서 찾을 수 있습니다. labellum에서 sensilla의 수와 위치는 틀에 박힌됩니다. 길이 (L), 중간 (I), 짧은 (S : 세 가지 형태의 길이에 따라 sensilla의 클래스가 있습니다 ) 7,8 sensilla. 각 sensillum 두 (I 형) 또는 4 개 (L-및 S-타입) 미각 수용체 뉴런 (GRNs) 9 중 하나가 포함되어 있습니다. 다른 GRNs 맛 자극의 서로 다른 카테고리에 응답 쓴, 설탕, 소금, 삼투압 7,10 및 미각 수용체 8,11-13의 다른 하위 집합을 표현한다. 만 I과 S-타입 sensilla 쓴 응답 GRNs 8,10가 포함되어 있습니다. subesophageal 신경절 (SOG)과 맛의 분자에 의해 자신의 활성화에 GRNs 프로젝트는 행동 반응 6 결과, 디코딩을위한 높은 중추 신경계로 전달된다. 뉴런의 상대적으로 적은 수의 분자 및 행동 분석에 복종 할 의무가 초파리의 맛 시스템 일반적으로 미각 시스템의 조사를위한 훌륭한 모델을합니다. 시스템이 유전 적 돌연변이 또는 GAL4-UAS 발현 시스템을 통해 조작 될 수있는 상대적 용이성은 또한 유용한 도구 14,15로서 기능한다.
이러한 sensilla가 labellum의 표면으로부터 돌출되어 있기 때문에 "ontent> 이들은 전기 생리학에 대한 우수한 표적을 만든다. GRNs의 소성은 세포 외 기록을 사용하여 모니터링 할 수있다. 역사적 삽입 유리 전극을 사용하여 측벽 기록 방법, sensillum 신경 활성을 기록하는, (26)이 사용되었다. 그러나,이 방법을 실시 할 기술적 도전과 롱 각 제제로부터 대해 기록하는 것이 곤란하다. 전극과 뉴런의 응답을 측정 팁 기록 방법, 즉 동시에 tastant을 제공, 이후 선택 9,16의 방법이되고있다. 그것은 초파리 8,10,17,18의 맛 시스템뿐만 아니라 다른 곤충 종의 19 ~ 23의 숫자를 조사하기 위해 활용되고 있습니다. 그것은이 크게 보상하여 팁 기록 방법의 주요 단점 중 하나를 극복 tastePROBE 증폭기의 개발에 의해 촉진 된GRN의 활동 전위가 과도한 증폭 또는 필터링 (24)없이 기록 할 수 있도록 상기 기준 전극 및 곤충 sensillum간에 큰 전위차. 또 다른 중요한 발전은 기록 전해질 (25) 등 tricholine 구연산을 사용했다. TCC는 삼투압에 민감한 GRN에서 반응을 억제하고 25 분석 훨씬 쉽게 쓴 설탕 tastants에 의해 생성 된 응답을하고, 소금에 민감한 GRN를 자극하지 않습니다.여기에서 우리는 초파리 labellar의 sensilla의 팁 녹화가 현재 칼슨 실험실에서 수행되는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 전기 생리학 방법 비행을 준비하는 장비, 방법과 맛 녹음을 수행하는 방법을 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 작업을 사용하는 경우 우리는 또한 초파리 sensilla의 하위 집합뿐만 아니라, 몇 가지 일반적인 문제와 발생할 수있는 잠재적 인 솔루션에서 기록하여 얻은 몇 가지 대표적인 데이터를 제공기술.
Protocol
Representative Results
Discussion
Labellar sensilla 인해 형태와 해부학 적 조직의 차이에 따라 기록의 용이성에 따라 다릅니다. 때때로 sensillum은 어떤 tastants에 긍정적 인 반응을 유도하는 것으로 알려져 한 마리도 응답하지 않습니다. 이 문제가 발생하는 빈도는 sensillum 유형에 따라 달라집니다. L의 sensilla 가장 일관되게 응답하는 인해 자신의 길이에 접근하기가 비교적 쉽다. 일반적으로, S의 sensilla는 지속적으로 반응하지만, 자신의…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (RD에) NRSA predoctoral 부여 1F31DC012985에 의해 JC에 NIH 보조금에 의해 지원되었다
우리는 도움을 컴파일하는 인물에 대한 원고, 라이언 박사 요셉에 도움이 코멘트 박사 리니 와이즈에게 감사하고, 도움이 기술적 조언 박사 프레드릭 마리온 – 설문 조사 것이다. 우리는 또한 네 개의 검토의 도움 의견을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
| Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
Referencias
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