術後免疫抑制のメカニズムを探索し、新しい周術期免疫療法を評価するための手術侵襲のマウス腫瘍モデル

1。 in vitroで 4T1腫瘍細胞を維持する 10cmの組織培養プレート中の完全DMEMで培養未修飾4T1腫瘍細胞（DMEM、10％FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン）。 37°C、5％CO 2組織培養インキュベーター中でインキュベートする。 スプリット培養2〜3回/週。最適な生存細胞を維持するために80％コンフルエンスを超えてはならない。培養は> 1ヶ月、in vitroで継代された場合には、これは、以前の継代した細胞よりも悪性度や転移の可能性を減少させるように、生体内の原発腫瘍を確立するための細胞を使用しないでください。 2。注射用収穫4T1腫瘍細胞パスツールピペットを用いて組織培養プレートから吸引し、培養培地。 2ミリリットルのEDTAを含む1Xの滅菌PBS 10ミリリットルを追加します。 PBS溶液を37℃で5-7分間、5％CO 2組織培養インキュベーターにてプレートでインキュベートしましょう。 プレートから収穫PBS溶液、R溶液を用いて、プレート2〜3倍をinsing、15ミリリットルコニカルチューブに移す。 ベンチトップ遠心分離機で4℃、500×gで5分間、遠心細胞。 上清を吸引し、無血清DMEM中で細胞ペレットを再懸濁します。 細胞カウンターを用いて細胞濃度を決定する。 1×10 6 cells/500に無血清培地で細胞を希釈して氷上に注入し、場所細胞についてμL（1×10 5 cells/50μL（。 3。 4T1腫瘍細胞をマウスに注射実行されたすべての動物実験は、同所注射または腫瘍移植を受けたすべての動物のためのオタワの勧告の大学の動物ケア獣医サービスの施設のガイドラインに従った。 疼痛管理のための手術前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を1時間で皮下マウスを扱う。 injecの期間中に2.5％イソフルランを使用して麻酔下でマウスを誘導し、維持するTiONから。反射反応を検出するために、マウスの足蹠ピンチ。何も検出されない場合、有効な麻酔レベルが達成される。無菌眼用潤滑剤は、次いで、角膜の乾燥を防ぐために適用される。 30 Gをロード½細胞懸濁液を正確に50μLの「超微細」注射器に。すべての気泡が気泡を取り除くために、注射器の側面をタップして、注射器の列から削除されていることを確認してください。 腹側を上に（麻酔下）にマウスを置きます。 アルコール綿を使用した注射部位をきれいにし、第4回乳房脂肪パッドに水平に直接針を導入し、ゆっくりとシリンジ容量を分注する。 すべての可能な漏れをきれいに綿棒を使用してください。 マウスは麻酔から回復することができます。 2日間、8時間毎に皮下投与した疼痛管理のためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgの）を維持する。 4。 BALB / cマウスベアリング4T1腫瘍における周術期治療を施す<p c小娘= "p1は">治療レジメンとインフルエンザワクチンの投与のための経路は、腫瘍溶解性ウイルス術前治療と同じです。 13日後に腫瘍細胞注射では、外部のキャリパーを使用して、原発腫瘍を測定します。ノギスでの最大の長径（長さ）および最大横径（幅）を測定します。修飾された楕円の式は、腫瘍体積（ 腫瘍体積 = 1/2（ 長さ Ã 幅 2）を計算するために使用される 13日後に腫瘍細胞注射では、原発腫瘍が約1cm 3を測定する必要があります。この腫瘍測定が達成されたときに、周術期治療試薬を調製する。 腫瘍溶解性ウイルスは、1が周術期に管理することができます1の革新的な治療である。注射の前に氷上で1×滅菌PBS、所定の位置に腫瘍溶解性ウイルス（1×10 9 PFU / 1ミリリットル）を準備します。 安全で場所をマウス静脈内尾部静脈注射のために拘束。 穏やかに外側尾静脈を可視化するために温かい水道水でマウス尾を加熱する。 27 Gをロード½ "インスリンシリンジ」の腫瘍溶解性ウイルス療法の正確100μlで。すべての気泡がシリンジカラムから除去されていることを確認。 外側尾静脈のいずれかに1×10 8 PFU/100μL/マウスでマウスを注入。針が適切に横静脈に挿入されている場合は、注射器を押し下げたときに、全く抵抗が感じられてはならない。 5。原発腫瘍の切除や腹部、左腎摘出を完了 14日後に腫瘍細胞注射で、オタワ動物管理獣医サービスの大学のプロトコルを承認し、次のルーチン周術期のケアを開始します。疼痛管理のための手術前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を1時間で皮下マウスを扱う。誘導し、手術中に2.5％イソフルランを使用して麻酔を維持。 UNDER条件を滅菌し、無菌手術器具を使用して、手術部位を剃毛し、スクラブされています。動物は、手術前に皮下流体および眼の潤滑剤を投与する。 穏やかに完全に乳房脂肪体から原発4T1腫瘍を除去するために小さな切開（長さ1〜2センチ）を作る。 2月3日9ミリメートルのステープルで切開を閉じます。 マウスの腹側正中線に沿って皮膚および皮下層を介して切断することにより、腹部を公開します。 マウスの腹膜にアクセスするための白線（3-4 CM）で切開する。 側に覆って腸を動かすことで、腹部の左側内側を公開します。腸を生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで湿った保たれていることを確認します。 外科鉗子の鈍ペアを使用して、静かに左腎臓を把握する。 ループに縛ら3-0ワックスコーティングされた編組絹縫合糸を使用して、左腎臓の門を連結し、3外科結び目で固定します。 surgiで左腎臓を削除CALはさみ。 十分な止血が達成されることを保証するために慎重に縫​​合タイを点検します。 9ミリメートルのステープルを使用して5-0編組吸収性、そして定番スキン層を使用した連続ループ縫合糸で皮下層を閉じます。 5.10への5.2は10分/動物を必要としなければならない手順。 2日間、8時間毎に皮下投与した疼痛管理のためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgの）を維持する。 6。安楽死マウスとその処理と肺腫瘍負荷の定量化 4T1腫瘍注入後28日目に、オタワ大学の動物管理獣医サービスのプロトコルに従ってマウスを安楽死させる。 70％エタノールでマウスを下にスプレーします。 ちょうど肋骨の下にはさみで最初の切開を行います。 マウスの胸腔の腹側正中線に沿って皮膚と皮下層を切断することで胸郭を公開します。 NEまでそれぞれの側の皮膚や組織を通って横方向の切開を作るマウスのCK。 肺の上下に結合組織を離れて切り取るながら優しく肺をつかんで、肺を解剖する。 予浸を10％緩衝化ホルマリン中に置き、次いで、残留血液を除去し、冷PBSで肺を抽出した。 腫瘍転移の評価のための各肺を撮影。腫瘍量の定量化のために肺の重量を量る。