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Medicina

Un tumore modello murino di stress chirurgico per esplorare i meccanismi di immunosoppressione post-operatorio e valutare Novel perioperatoria Immunoterapie

Published: March 12, 2014
doi:
10.3791/51253
, , , , , ,
1Centre for Innovative Cancer Research,Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine,University of Ottawa, 3Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology,University of Ottawa, 4Department of Neurosurgery,The Second Hospital of Shandong University, 5Department of Medical Laboratory Technology,University of Tabuk, 6Department of Surgery,Ottawa General Hospital

Summary

Un modello di tumore di topo di stress chirurgico viene utilizzato per esplorare come postoperatorio soppressione immunitaria promuove la malattia metastatica e per valutare le terapie perioperatorie immunostimolante.

Abstract

La resezione chirurgica è un trattamento essenziale per molti pazienti, ma la chirurgia induce disfunzione del sistema immunitario e questo è stato collegato allo sviluppo della malattia metastatica in modelli animali e in pazienti affetti da cancro. Lavoro preclinico dal nostro gruppo e altri ha dimostrato una profonda soppressione della funzione immunitaria innata, in particolare le cellule NK nel periodo postoperatorio e questo gioca un ruolo importante nella maggiore sviluppo delle metastasi dopo l'intervento. Relativamente pochi studi sugli animali e studi clinici si sono concentrati sulla caratterizzazione e invertire gli effetti negativi di chirurgia del cancro. Utilizzando un modello rigoroso di tumori spontaneamente metastatizzanti e stress chirurgico animale, il miglioramento della chirurgia del cancro sullo sviluppo delle metastasi polmonari è stata dimostrata. In questo modello, le cellule del cancro al seno 4T1 vengono impiantati nel topo cuscinetto adiposo mammario. Al 14 ° giorno dopo l'impianto del tumore, una resezione completa del tumore mammario primario è esibirannod in tutti gli animali. Un sottoinsieme di animali riceve stress chirurgico supplementare, sotto forma di una nefrectomia addominale. Al giorno 28, noduli tumorali del polmone sono quantificati. Quando immunoterapia stato dato immediatamente preoperatoria, è stata rilevata una profonda attivazione delle cellule immunitarie che ha impedito lo sviluppo di metastasi dopo chirurgia. Mentre il modello chirurgia del tumore al seno 4T1 permette la simulazione degli effetti di stress chirurgico addominale sulle metastasi tumorali, la sua applicabilità ad altri tipi di tumore deve essere testato. La sfida attuale è quella di identificare immunoterapie sicure e promettenti in modelli preclinici mouse e di tradurle in terapia perioperatoria vitali da dare ai pazienti di chirurgia del cancro per prevenire la recidiva della malattia metastatica.

Introduction

La chirurgia è una componente fondamentale nel trattamento del cancro curativo dei tumori solidi, ma nonostante la resezione completa, molti pazienti sviluppano una recidiva metastatica e, infine, muoiono della loro malattia. Sempre più spesso, il periodo postoperatorio, a seguito della risposta allo stress fisiologico, chirurgia, compresa la coagulazione del sangue, il rilascio di fattori di crescita, e soppressione immunitaria, è riconosciuto come momento critico per lo sviluppo di metastasi. Il nostro gruppo 1,2 e altri 3-5 hanno dimostrato che postoperatorio è un momento unico suscettibile alla formazione di metastasi.

Uno dei meccanismi principali responsabili degli effetti prometastatic della chirurgia è la disfunzione postoperatoria dei Natural Killer (NK) 1-3. Cellule NK sono linfociti citotossici del sistema immune innato coinvolto nel controllo della crescita tumorale e metastasi 6. Disfunzione delle cellule NK dopo intervento chirurgico è stato documentato in sia pazienti umani 1,7-9 e modelli animali 1,10,11. Soppressione delle cellule NK postoperatoria correla con un aumento metastasi in modelli animali di spontanei e impiantati metastasi 1,11-14, mentre negli studi umani, bassa attività NK durante il periodo perioperatorio è associata ad un più alto tasso di ricorrenza del cancro e della mortalità 15,16.

Nonostante questo, attualmente non esistono terapie oncologiche affrontare specificamente le modifiche prometastatic che si verificano immediatamente dopo la chirurgia del cancro. Il periodo perioperatorio rappresenta una finestra di opportunità terapeutica in cui intervenire nel processo metastatico. Mentre terapie oncologiche tradizionali, come la chemioterapia citotossica, sono considerati troppo tossico per essere somministrato a pazienti sottoposti a interventi di chirurgia maggiore 17, terapie immunitarie sono candidati ideali per la somministrazione perioperatoria. Impiego perioperatorio dei ricombinante IL-2 e IFN-Î ³ sono stati esplorati in fase iniziale studi clinici che dimostrano il loro potenziale per impedire la soppressione post-operatorio delle cellule NK e migliorare la sopravvivenza libera da progressione 18-21. Purtroppo, l'ulteriore sviluppo è stato ostacolato da tollerabilità di questa terapia con citochine aspecifica combinata con interventi di chirurgia maggiore 17. I virus sono potenti attivatori non specifici delle cellule NK. La nostra ricerca ha già dimostrato che la somministrazione preoperatoria di virus replicanti, come il romanzo anti-cancro Oncolytic virus (OV), e nonreplicating vaccini virali, come vaccino contro l'influenza, può inibire la disfunzione delle cellule NK chirurgia indotta e attenuare la malattia metastatica 1,22.

Il modello chirurgico descritto in questo documento ha facilitato la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nella diffusione e la crescita delle cellule tumorali dopo l'intervento chirurgico e ci ha permesso di esplorare nuove terapie mirate che possono essere somministrati nel periodo perioperatorio. Per raggiungere questo obiettivo, un animalemodello di stress chirurgico e spontanea metastasi batuffolo sviluppato. Il modello fa uso di carcinoma del seno topo (BALB / c 4T1 -) che sono in grado di metastatizzare spontaneamente dalla ghiandola mammaria primario a più siti distanti in particolare i polmoni. Al giorno 0, le cellule di cancro al seno sono impiantati nel mouse pad grasso del seno. Al 14 ° giorno dopo l'impianto del tumore, una resezione completa del tumore mammario primario viene eseguita in tutti gli animali. Un sottoinsieme di animali riceve stress chirurgico supplementare, sotto forma di una nefrectomia addominale. Al giorno 28, noduli tumorali del polmone in chirurgicamente stressati e senza topi di controllo chirurgia confronto sono isolati e quantificati. In questo modello animale di cancro e chirurgia, gli effetti della chirurgia sulle metastasi tumorali sono allo studio e l'efficacia della somministrazione perioperatoria di immunoterapie innovative, tra cui la replica e nonreplicating immuno-stimolanti a base virale sono testati per la prima volta.

Protocol

1. Mantenere 4T1 cellule tumorali in vitro Cultura modificate cellule tumorali 4T1 in DMEM completo (DMEM 10% FBS, 1x penicillina / streptomicina) in 10 centimetri di tessuto piastre di coltura. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 tessuto cultura incubatore. Culture Split 2-3 volte / settimana. Per mantenere le cellule redditività ottimale non dovrebbe superare l'80% di confluenza. Non utilizzare le cellule per l'istituzione di tumori primari in vivo se culture sono state posto in vitro for> 1 mese come questo riduce neoplasia e il potenziale metastatico delle cellule in precedenza diversi passaggi. 2. Raccolta 4T1 cellule tumorali per iniezione Aspirare il mezzo di coltura dalla piastra di coltura tissutale con una pipetta Pasteur. Aggiungere 10 ml di 1x PBS sterile contenente 2 ml di EDTA. Sia la soluzione PBS incubare nella piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per coltura tissutale 5-7 min. Soluzione Harvest PBS dalla piastra, rinsing la piastra 2-3x con la soluzione, trasferire 15 ml tubo conico. Cellule di centrifugazione per 5 min a 500 xg, a 4 ° C, in una centrifuga da banco. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in DMEM privo di siero. Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore di cella. Diluire le cellule con terreno privo di siero di 1×10 6 cells/500 microlitri (1×10 5 cells/50 microlitri (per le celle di iniezione e posto sul ghiaccio. 3. Iniettare topi con 4T1 cellule tumorali Tutti gli studi effettuati sugli animali erano in conformità con le linee guida istituzionali a cura degli animali Servizi Veterinari dell 'Università di Ottawa raccomandazioni per tutti gli animali trattati con iniezioni ortotopici o impianti tumorali. Trattare topi per via sottocutanea con buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 ora prima dell'intervento chirurgico per la gestione del dolore. Indurre e mantenere topo sotto anestesia con isoflurano 2,5% durante la durata della iniezionezione. Stringere la zampa del mouse per rilevare risposta riflessa. Se viene rilevata nessuna, livelli anestesia efficaci sono raggiunti. Sterile lubrificante occhio viene poi applicato per prevenire l'essiccazione della cornea. Caricare un 30 G ½ in siringa "Ultra-fine" proprio con 50 ml di cellule di sospensione. Assicurarsi che tutte le bolle d'aria vengono rimosse dalla colonna siringa toccando il lato della siringa per rimuovere le bolle d'aria. Posizionare il mouse (sotto anestesia) ventrale verso l'alto. Pulire il sito di iniezione con il tampone con alcol e introdurre l'ago orizzontalmente e direttamente nella 4a pad grasso mammario, lentamente dispensare il volume della siringa. Usare un tampone di cotone per pulire eventuali perdite. Consentire topi per recuperare da anestesia. Mantenere buprenorfina (0,05 mg / kg) per la gestione del dolore sc somministrati ogni 8 ore per 2 giorni. 4. Amministrazione perioperatoria trattamento in 4T1 tumore Cuscinetto BALB / c Mice <p class = "p1"> Il regime di trattamento e di rotta per la somministrazione del vaccino influenzale è identico al trattamento virus preoperatoria oncolytic. Con 13 giorni di iniezione cellula post-tumore, misurare il tumore primario utilizzando una pinza esterna. Misurare il diametro longitudinale (lunghezza) e la maggior diametro trasversale (larghezza) con la pinza. La formula ellissoidale modificata viene utilizzata per calcolare il volume del tumore (volume del tumore = 1/2 (lunghezza à larghezza 2) A 13 giorni di iniezione cellula post-tumore, il tumore primario dovrebbe misurare circa 1 cm 3. Quando questa misura tumore è raggiunto, preparare perioperatoria reagente terapia. Virus oncolitici è una terapia innovativa che si può gestire nel periodo perioperatorio. Preparare virus oncolitici (1×10 9 PFU / 1 ml) in 1x PBS sterile e posto sul ghiaccio prima dell'iniezione. Sicuro e posto del mousein restrainer per l'iniezione coda vena endovenosa. Riscaldare delicatamente coda di topo in acqua tiepida per visualizzare le vene coda laterali. Caricare un 27 G ½ in "Siringa", proprio con 100 ml di terapia virus oncolitici. Assicurarsi che tutte le bolle d'aria vengono rimosse dalla colonna siringa. Iniettare il mouse con 1×10 8 PFU/100 microlitri / mouse a una delle vene coda laterali. Se l'ago è opportunamente inserito in una vena laterale, nessuna resistenza deve essere sentito quando si preme la siringa. 5. Resezione completa del tumore primario e addominale sinistra nefrectomia A 14 giorni di iniezione cellula post-tumorale, di avviare l'assistenza perioperatoria di routine seguente Università di Ottawa cura degli animali e Servizio Veterinario protocolli approvati. Trattare topi per via sottocutanea con buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 ora prima dell'intervento chirurgico per la gestione del dolore. Indurre e mantenere l'anestesia con isoflurano 2,5% durante l'intervento chirurgico. Under condizioni e utilizzando gli strumenti chirurgici sterili sterilizzati, sito chirurgico è rasato e rimosso. Gli animali vengono somministrati liquidi per via sottocutanea e lubrificante occhio prima di un intervento chirurgico. Fai una piccola incisione (1-2 cm di lunghezza) per rimuovere delicatamente e completamente il primario 4T1 tumore del cuscinetto adiposo mammario. Chiudere l'incisione con 2-3 9 millimetri graffette. Esporre l'addome tagliando attraverso la pelle e lo strato sottocutaneo lungo la linea mediana ventrale del mouse. Effettuare una incisione alla linea alba (3-4 cm) per accedere topo peritoneo. Esporre il lato interno sinistro dell'addome muovendo le viscere sovrastanti a lato. Assicurarsi che gli intestini sono tenuto umido con una soluzione salina imbevuta garza sterile. Usando un paio di pinze chirurgiche smussato, afferrare il rene sinistro delicatamente. Utilizzando una sutura di seta intrecciata rivestita 3-0 cera legato in un ciclo, legare l'ilo del rene sinistro e fissare con 3 nodi chirurgici. Rimuovere il rene sinistro con surgiforbici cal. Controllare attentamente il legame sutura per garantire che un'adeguata emostasi è raggiunto. Chiudere lo strato sottocutaneo con una sutura ciclo continuo utilizzando 5-0 intrecciata assorbibile, strato di pelle allora fiocco con 9 millimetri graffette. I passaggi 5,2-5,10 dovrebbe richiedere 10 min / animale. Mantenere buprenorfina (0,05 mg / kg) per la gestione del dolore sc somministrati ogni 8 ore per 2 giorni. 6. I topi eutanasia e Lavorazione e quantificazione dei polmoni Tumore Burden A 28 giorni post-4T1 iniezione di tumore, i topi eutanasia secondo il protocollo cura degli animali e servizi veterinari presso l'Università di Ottawa. Spray giù il mouse con il 70% di etanolo. Fai incisione iniziale con le forbici appena sotto la gabbia toracica. Esporre il torace tagliando attraverso la pelle e lo strato sottocutaneo lungo la linea mediana ventrale della cavità toracica del mouse. Fai incisioni laterali attraverso la pelle e il tessuto su ogni lato fino alla neck del mouse. Sezionare i polmoni afferrando delicatamente il polmone mentre tagliandole il tessuto connettivo sopra e sotto i polmoni. Presoak estratto polmoni in PBS freddo per rimuovere i residui di sangue, quindi collocare nel 10% formalina tamponata. Fotografare ogni polmone per la valutazione delle metastasi tumorali. Pesare i polmoni per carico tumorale quantificazione.

Representative Results

È stato sviluppato un modello riproducibile topo di stress chirurgico che nel drammatico aumento delle metastasi polmonari. Al giorno 28 dopo 4T1 inoculazione del tumore (e 14 giorni dopo resezione del tumore + / – nefrectomia addominale), i polmoni sono stati raccolti e visualizzati per le metastasi. Chirurgia chiaramente aumenta la quantità di metastasi polmonari rispetto ai topi non trattati come dimostrato dalle fotografie polmonari (Figura 1A), la conta di noduli polmonari (Figura 1B) e peso polmonare (Figura 1C). La somministrazione preoperatoria di replicare il virus oncolitici e del vaccino antinfluenzale inattivato salva significativamente gli effetti prometastatic di chirurgia del cancro (Figure 1A-C). Per determinare se le cellule NK svolgono un ruolo di mediazione nel prevenire metastasi trattamento post-vaccino, cellule NK sono stati esauriti farmacologicamente utilizzando anti-asialo-GM-1 nel modello di metastasi tumorale. In assenza di NKcellule, abbiamo osservato una abrogazione dell'effetto terapeutico di immunoterapie perioperatori (Figure 2A e 2B). Questi dati suggeriscono che la rimozione metastasi tumorali nel nostro modello stress chirurgico è mediata principalmente attraverso virus e il vaccino oncolytic l'attivazione delle cellule NK e conseguente lisi tumorale NK mediata. Per caratterizzare ulteriormente la funzione delle cellule NK in seguito alla somministrazione perioperatoria di virus oncolitici e vaccino contro l'influenza, è stata valutata ex-vivo uccisione delle cellule NK. In breve, riunite e filtrate DX5 + cellule NK sono state isolate da splenociti di chirurgicamente stressati e topi di controllo. Sono stati co-coltivate per 4 ore con cromo marcato YAC-1 le cellule bersaglio, a diversi Effector a Target rapporti, seguita da misurazione del surnatante rilascio di cromo con un contatore gamma. Un significativo intervento chirurgico difetto indotto citotossicità delle cellule NK insieme ad un significativo recupero di NK uccisione a seguito della somministrazione perioperatoria di virus oncolitici e inflvaccino uenza rispetto alla sola chirurgia è stato osservato (Figure 2C e 2D). Presi insieme, questi risultati dimostrano che la soppressione delle cellule NK perioperatorio può essere trattata con successo e malattia metastatica ridotta con nuove terapie immunostimolanti. Figura 1. Anti-cancro e virus influenzale vaccino oncolytic romanzo come terapia perioperatoria contro la chirurgia indotta valorizzazione delle metastasi polmonari. Valutazione di 4T1 metastasi del tumore al polmone al giorno 28 di gruppi di trattamento indicati da (A) fotografie di polmoni rappresentative, (B) enumerazione di tumore al polmone noduli e (C) pesi polmonari. I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti simili con n = 5-10/group (*, p = 0.01; **, p <0.0001; ns, non significativo). cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Stress chirurgico aumenta polmone metastasi tumorali alterando cellule NK. (A, B) Quantificazione del polmone metastasi tumorali chirurgicamente sottolineato topi trattati con nuova terapia perioperatoria. (C, D) La capacità di DX5 purificato + cellule NK da chirurgicamente stressato e controlli non trattati per uccidere le cellule tumorali. I dati vengono visualizzati come la percentuale media (+ / – SD), del rilascio di cromo dai pozzi triplicato per l'indicato E: T rapporti. I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti simili dove n = 4-5/group (*, p = 0.01; **, p <0,005, ns, non significativo)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

La resezione chirurgica è il cardine della terapia per i pazienti con tumori solidi localizzati. Anche con resezione completa, molti pazienti sviluppano una recidiva metastatica e, infine, muoiono della loro malattia. Postoperatorio fornisce un ambiente ideale per la formazione di metastasi tumorali, modulata, in gran parte, dalla soppressione postoperatoria cellule NK. Nonostante questo, rimane una finestra terapeutica che è largamente ignorato. Non ci sono terapie standard anti-cancro perioperatorie volti a prevenire le metastasi postoperatorie. La sfida attuale è quella di identificare terapie sicure e promettenti che si attiveranno le cellule NK nel periodo perioperatorio impedendo così la creazione di malattia micrometastatica. Queste terapie devono essere rigorosamente caratterizzati per la sicurezza e l'efficacia in modelli animali preclinici e poi tradotti in studi clinici studiati.

Il rapporto primarionale di sviluppare un modello di tumore murino di stress chirurgico è esplorare meccanismi di soppressione immunitaria e diffusione metastatica dopo intervento chirurgico e per valutare immunoterapie innovative con potenziale per un uso futuro nei pazienti oncologici sottoposti a chirurgia per rimuovere il tumore primario. Per raggiungere questo obiettivo, un modello murino 4T1 carcinoma mammario accoppiato con stress chirurgico è stato sviluppato. Mentre la linea cellulare 4T1 è un murino "carcinoma mammario", la ragione per usare questa linea cellulare è la riproducibilità delle metastasi spontanee che ci permette di valutare gli effetti dello stress chirurgico in un modello di cancro realistica. In questo contesto, la vera origine del tumore maligno è meno importante del potenziale metastatico e biologia del tumore. Il secondo componente fondamentale del nostro modello è lo sviluppo di una procedura chirurgica animale per assomigliare chirurgia del cancro umano. In questo modello animale stress chirurgico, il primario 4T1 tumore al seno viene asportato dopo che raggiungerà 1 cm3. Perchéambulatori del cancro in pazienti umani comportano una significativa soppressione immunitaria, una nefrectomia aperto l'addome in "stress chirurgico" gruppi di trattamento viene eseguito in aggiunta. Come si confronta con più resezione del tumore convenzionali negli esseri umani, la natura invasiva di una nefrectomia completamente a sinistra è molto paragonabile a numerosi tipi di trattamenti chirurgici per tumori solidi, compresa la chirurgia per cancro colorettale, cancro ovarico, tumore del rene, cancro del pancreas, del polmone e dell'esofago cancro. Inoltre, vorremmo sostenere che i profondi cambiamenti fisiologici che si verificano nel periodo perioperatorio, a causa di laparotomia + nefrectomia, riproduce in modo adeguato i cambiamenti fisiologici travolgente che si verificano in seguito a chirurgia invasiva per la maggior parte dei tumori solidi. Per controllare i fattori perioperatorie che potrebbero portare ad un eccessivo stress chirurgico e la mortalità, la durata dell'anestesia e della chirurgia e mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico è definito con precisione. Tutti questi parametri vengono eseguiti con precisione und definito nel nostro protocollo chirurgico per rispecchiare l'assistenza perioperatoria di routine in pazienti con cancro umano.

La tempistica dei trattamenti perioperatoria è un componente fondamentale aggiuntivo per il modello soccorso perioperatorio. Topi portatori di tumore 4T1 sono stati precedentemente trattati con 3 regimi di vaccino antinfluenzale: neoadiuvante (dato 5 giorni prima dell'intervento), perioperatoria (data lo stesso giorno dell'intervento) e perioperatoria + multidose (dato il giorno dell'intervento, seguiti da 2 dosi aggiuntive dato 5 giorni di distanza). Sorprendentemente, tutte e 3 le modalità di trattamento vaccino sono diminuite significativamente metastasi polmonari 22. Tuttavia, vaccino antinfluenzale somministrato nel periodo perioperatorio in dose singola metastasi ridotte in modo più efficace. Collettivamente, questi esperimenti sottolineano l'importanza del periodo perioperatorio immediato come una stretta finestra terapeutica per intervenire nel processo metastatico.

Uso perioperatorio di immunoterapie innovative come oncolyvirus tic e vaccini sono stati esclusivamente limitati al nostro gruppo di ricerca. Abbiamo dimostrato per la prima volta che la somministrazione perioperatoria del romanzo ORF oncolytic e vaccinia virus in grado di invertire la soppressione delle cellule NK dopo intervento chirurgico in modelli animali 1. Ancora più importante, questo salvataggio della funzione immunitaria correla con una riduzione della formazione di metastasi postoperatorio. Negli studi sugli esseri umani, pazienti sottoposti a chirurgia del cancro postoperatorio avevano ridotto la citotossicità delle cellule NK e perioperatoria OV aumenta notevolmente l'attività delle cellule NK nei pazienti oncologici 1. Utilizzando disponibili in commercio vaccini profilattici, abbiamo dimostrato che la somministrazione di vaccino antinfluenzale perioperatoria ha ridotto significativamente le metastasi tumorali e migliorato citotossicità delle cellule NK in modelli tumorali preclinici. Negli studi sugli esseri umani, il vaccino influenzale migliorato significativamente l'attività delle cellule NK in donatori umani sani e pazienti della chirurgia del cancro 22.

Molti approcci sono utilizzati per ridurre cancer la ricorrenza, tra cui la chemioterapia e le radiazioni, ma queste terapie sono di solito somministrati settimane a mesi prima (neoadiuvante) o dopo (adiuvante) Chirurgia. La ricerca in questo campo mostra che il periodo post-operatorio immediato è fondamentale nel determinare a lungo termine i tassi di recidiva del tumore. Pertanto, interventi clinici in forma di immunoterapie durante questo periodo critico possono avere benefici sostanziali a lungo termine. I nostri studi utilizzando un modello murino di metastasi polmonari spontanea e stress chirurgico offrono un'opportunità unica di esplorare nuove terapie e determinare il loro potenziale per prevenire immunosoppressione perioperatoria in pazienti sottoposti a chirurgia del cancro e ridurre così anche il cancro tassi di recidiva.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare te Kim Yates, Eileen Franklin, e Rebecca Tjepkema (cura degli animali e servizi veterinari, Università di Ottawa) per l'assistenza con interventi chirurgici su animali. Lee-Hwa Tai è supportato da un Fonds de recherche santé Quebec Fellowship. Questo lavoro è stato sostenuto da contributi in conto esercizio della Canadian Cancer Society Research Institute innovazione Grant, Ontario Ministero della Ricerca e Sviluppo Ricercatore Primo Premio, e Canadian Foundation for Innovation – Leader Opportunity di Grant a Rebecca Auer.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning Cell-Gro 10-013-CV
Inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) HyClone SH30396.03
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063
1X sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning cell gro 21-031-CV
Buprenorphine Chiron, Guelph RXN309968
Isofluorane Baxter Corp 1001936040
1/2 ultra-fine syringe Terumo 30 Gauge, SS05M3009
9mm staples Braintree ACS BX
5-0 braided absorbable suture Covidien UL-202
3-0 wax braided silk suture Covidien S-194
Formalin Fisher SF100-20
4T1 tumor cells ATCC CRL-2539
BALB/c Charles Rivers Labs Strain Code:028
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Referencias

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Tai, L., Tanese de Souza, C., Sahi, S., Zhang, J., Alkayyal, A. A., Ananth, A. A., Auer, R. A. A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies. J. Vis. Exp. (85), e51253, doi:10.3791/51253 (2014).
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