手术应激探索术后免疫抑制的机制和评估新围手术期免疫疗法的小鼠肿瘤模型

1。保持4T1肿瘤细胞在体外 培养未修改的4T1肿瘤细胞的完全DMEM培养液（DMEM，10％FBS，1×青霉素/链霉素）的10厘米的组织培养板中。孵育在37℃，5％CO 2的细胞培养箱。 文化分裂2-3次/周。为保持最佳活力细胞不应该超过80％汇合。不要使用细胞建立体内的原发性肿瘤，如果文化已经传代体外 > 1个月，因为这降低恶性肿瘤转移潜能比早期传代细胞。 2。收获4T1肿瘤细胞注射从用巴氏吸管的组织培养板中吸出培养基。 加入含2ml EDTA10毫升1X无菌PBS。让的PBS溶液，在37℃，5％CO 2的组织培养箱中5-7分钟孵育的板。 从板河收获PBS溶液insing板2-3X使用的解决方案，转移到15毫升锥形管。 细胞离心5分钟，在500×g离心，在4℃下，在台式离心机。 吸去上清，重悬在无血清的DMEM将细胞沉淀。 用细胞计数测定细胞浓度。 稀释的细胞用无血清培养基中以1×10 6 cells/500微升（1×10 5 cells/50微升（用于注射和定位细胞于冰上。 3。注射小鼠4T1肿瘤细胞完成所有的动物研究是根据在渥太华建议大学动物护理兽医服务用于接收原位注射或植入肿瘤的所有动物的组织指导方针。 皮下注射治疗小鼠丁丙诺啡（0.05毫克/千克）手术疼痛管理前1小时。 诱导并用注射的持续时间期间2.5％的异氟醚麻醉下保持鼠标化。捏鼠标的脚垫来检测反射反应。如果没有检测到，有效的麻醉水平达到了。无菌眼润滑剂，然后应用到防止角膜干燥。 加载一个30 G½在“超精细”注射器正是50微升的细胞悬液。确保所有的气泡被从注射器柱通过敲击注射器的侧撞出气泡除去。 将鼠标（麻醉下）腹朝上。 用酒精棉签清洁注射部位和水平，并直接引入进针第四届乳腺脂肪垫，慢慢地免除注射器体积。 用棉签清理任何可能的泄漏。 让小鼠从麻醉中恢复。 保持丁丙诺啡（0.05毫克/千克）的疼痛管理管理SC，每8小时2天。 4。在4T1荷瘤BALB / c小鼠管理围手术期处理<p c小姑娘="“P1”">的治疗方案和途径流感疫苗给药是相同的溶瘤病毒的术前治疗。 13天后肿瘤细胞注射，使用外部卡尺测量原发性肿瘤。测量的最大长径（长度）和最大横直径（宽度）与卡钳。修改后的椭圆体的公式用于计算肿瘤体积（ 肿瘤体积 = 1/2（ 长度为宽度的 2） 13天后肿瘤细胞注射，原发肿瘤应该测量大约1 立方厘米 。当这个肿瘤测量达到后，准备围手术期治疗试剂。 溶瘤病毒是创新的治疗，人们可以在围手术期管理。制备溶瘤病毒（1×10 9 PFU / 1毫升）在1x无菌PBS中，置于冰上注射前。 安全和鼠标的地方为阻挡器尾静脉注射。 轻轻地热鼠尾在温暖的自来水，以可视化的侧面尾静脉。 恰恰与100微升的溶瘤病毒治疗加载一个27 G½在“胰岛素注射器”。确保所有气泡从注射器列中删除。 用1×10 8 PFU/100微升/鼠注入鼠标的侧面尾静脉中的一个。如果针被适当地插入侧脉，无阻力，应按压注射器时，可以感觉到。 5。原发肿瘤和腹部左侧肾切除术中完整切除 14天后肿瘤细胞注射，开始例行的围手术期护理以下渥太华动物护理和兽医服务的大学认可的协议。皮下注射治疗小鼠丁丙诺啡（0.05毫克/千克）手术疼痛管理前1小时。诱发和使用在手术过程中2.5％异氟烷维持麻醉。 üNDER无菌条件下，使用无菌手术器械，手术部位被剃光，并擦洗。动物被施用在手术前皮下流体和眼的润滑剂。 做一个小切口（1-2厘米长）从乳腺脂肪垫轻轻地，彻底切除原发肿瘤4T1。 关闭切口用2-39毫米主食。 通过沿小鼠的腹侧中线皮肤和皮下组织层切割露出腹部。 做一个切口在白线（3-4厘米）来访问小鼠腹膜。 通过移动覆盖大便到侧露出腹部的左内侧。确保肠子都保持湿润，用生理盐水浸湿无菌纱布。 用钝对手术镊子，轻轻抓住了左肾。 使用3-0涂蜡编织丝线绑成一个环，结扎左肾肾门和3外科结固定。与surgi取出左肾卡尔剪刀。 仔细检查缝合的领带，以确保有足够的止血的实现。 使用5-0编织吸收，然后主食皮肤使用9毫米主食层连续缝合环闭合皮下层。步骤5.2至5.10应该要求10分钟/动物。 保持丁丙诺啡（0.05毫克/千克）的疼痛管理管理SC，每8小时2天。 6。小鼠实施安乐死及加工和肺部肿瘤负担定量在28天后4T1肿瘤注射，根据动物护理和兽医服务在渥​​太华大学协议安乐死小鼠。 喷下来鼠标用70％乙醇。 使最初的切口，用剪刀只是下方的肋骨。 通过沿着鼠标的胸腔腹正中线皮肤和皮下组织层切割露出胸部。 通过皮肤和组织每侧到NE使横向切口CK鼠标。 通过轻轻抓肺而剪断相差结缔组织上方和下方的肺部解剖出肺。 预浸提取的肺中冷PBS以除去残留的血液，然后放置在10％缓冲福尔马林。 拍摄每个肺肿瘤转移的评估。权衡肺部肿瘤负荷定量。