Slice Cervello biotinilazione: An<em> Ex Vivo</em> Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti
Summary
Traffico di membrana neuronale controlla dinamicamente la membrana plasmatica disponibilità di proteine e gli impatti in modo significativo la neurotrasmissione. Ad oggi, è stato impegnativo per misurare neuronale traffico endocitico in neuroni adulti. Qui, descriviamo un metodo quantitativo altamente efficace per misurare rapidi cambiamenti nell'espressione della proteina superficie ex vivo in fettine cerebrali acute.
Abstract
Traffico endocytic regolamentata è il meccanismo centrale facilitando una serie di eventi neuromodulatori, controllando dinamicamente recettore, canale ionico, e la cella presentazione superficie trasportatore su una scala minuti di tempo. C'è una vasta diversità di meccanismi che controllano il traffico endocitico delle singole proteine. Gli studi che indagano le basi molecolari del traffico hanno fatto affidamento principalmente sulla biotinilazione superficie per misurare quantitativamente cambiamenti nell'espressione superficiale proteina di membrana in risposta a stimoli esogeni e la manipolazione genetica. Tuttavia, questo approccio è stato limitato principalmente alle cellule coltivate, che potrebbero non riflettere fedelmente i meccanismi fisiologicamente rilevanti in gioco in neuroni adulti. Inoltre, gli approcci di cellule in coltura possono sottovalutare le differenze regionali specifici meccanismi di traffico. Qui, descriviamo un approccio che si estende biotinylation superficie cellulare per la preparazione fetta acuta cervello. Noidimostrano che questo metodo fornisce un approccio ad alta fedeltà per misurare rapidi cambiamenti nei livelli superficiali delle proteine di membrana in neuroni adulti. Questo approccio rischia di avere un ampio programma di utilità nel campo del traffico endocytic neuronale.
Introduction
Traffico endocitico è un meccanismo cellulare ubiquitario che perfeziona la presentazione membrana plasmatica di una varietà di proteine integrali di membrana. Endocitosi fornisce nutrienti vitali per l'ambiente intracellulare 1 e desensibilizza segnalazione dei recettori in risposta all'attivazione del recettore 2. Riciclo indietro alla membrana plasmatica endocitosi può inoltre migliorare segnalazione cellulare aumentando i livelli di espressione della proteina sulla superficie cellulare 3. Inoltre, perturbazioni traffico di membrana sono implicati in numerose malattie e condizioni patologiche 4,5, sottolineando la necessità di studiare i meccanismi molecolari che governano la proteina traffico endocitico. Mentre molte proteine utilizzano meccanismi di internalizzazione classici clatrina-dipendente, prova di montaggio nel corso degli ultimi anni dimostra che più i meccanismi di endocitosi clatrina-indipendente governano il potenziale endocitica di una serie crescente diproteine 6,7. Quindi, la necessità di indagare i meccanismi endocitiche agevolare il traffico nei sistemi pertinenti fisiologici è cresciuta notevolmente.
Nel cervello, il traffico endocitico dei recettori, canali ionici e trasportatori di neurotrasmettitori ha un ruolo primario nella creazione di plasticità sinaptica 8-11 e risposta ai farmaci d'abuso 12-15, in ultima analisi, un impatto eccitabilità neuronale e risposte sinaptiche. Ad oggi la maggior parte degli studi di traffico neuronali contare su entrambi i sistemi di espressione eterologa o neuroni primari in coltura, nessuno dei quali può riflettere in maniera affidabile i meccanismi in gioco in neuroni adulti. Qui riportiamo un approccio che utilizza biotinilazione superficie per misurare quantitativamente i livelli di proteina di superficie in fettine cerebrali acute derivanti da roditori adulti. Usando questo approccio, presentiamo i dati che dimostrano che il topo striato trasportatore della dopamina interiorizza rapidamente in rerisposta a forbolo estere mediata proteina chinasi C (PKC) attivazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante la conoscenza di lunga data che il traffico endocytic criticamente l'impatto segnalazione sinaptica nel cervello, si è dimostrato impegnativo per misurare quantitativamente cambiamenti nell'espressione superficie della proteina nei neuroni adulti. In questo lavoro, riportiamo un metodo affidabile per etichettare proteina di superficie ex vivo in fettine cerebrali acute. Preparazioni fetta cervello hanno una lunga storia di utilità per le registrazioni elettrofisiologiche, in quanto mantengo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH sovvenzioni DA15169 e DA035224 di HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
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