Capsulare Sierotipizzazione di<em> Streptococcus pneumoniae</em> Utilizzo della reazione Quellung

1. Preparazione della sospensione cellulare per la tipizzazione Utilizzando un usa e getta loop 1 ml sterile, prendere una piccola distesa di pernottamento pura cultura fresca di pneumococchi cresciuto su un solido agar sangue di cavallo non selettivo e inoculare 100 ml Heart Infusion (HI) brodo. La sospensione dovrebbe apparire solo visibilmente torbido. Agitare delicatamente il tubo per emulsionare. Nota: Altri media come Brain Heart Infusion brodo possono essere idonei. Aggiunta di siero (ad esempio una concentrazione finale di 10% (v / v) di siero di cavallo) ed incubazione a 37 ° C per circa 1 ora prima dell'uso può essere utilizzato per migliorare la reazione. 2. Controllo Densità di sospensione cellulare La sospensione cellulare preparato al punto 1.1 sarà anche utilizzato come controllo negativo, e dovrebbe essere controllato per densità delle cellule prima di aggiungere i sieri digitazione. Utilizzando un ciclo 1 ml, trasferire una goccia d'inoculo preparato nella fase 1.1 su un bicchieres vetrino da microscopio. Usando un paio di pinze, mettere un piccolo vetrino circolare sulla sospensione. Utilizzando l'impostazione a contrasto di fase, osservare la preparazione al microscopio sotto 400X ingrandimento, per verificare la densità della sospensione (Figura 1A). Se l'inoculo è troppo pesante (Figura 2A), aggiungere altro brodo alla sospensione cellulare fatta allo step 1.1 diluirlo. Mescolare ancora delicatamente. Se l'inoculo è troppo leggero, per esempio, ci sono <50 cellule visibile nel campo microscopico (Figura 2B), aggiungere più batteri alla preparazione sospensione cellulare fatta allo step 1.1 e mescolare delicatamente. Nota: Con l'esperienza, la densità della sospensione cellulare può essere giudicata agitando e sollevando alla luce, dove dovrebbe apparire solo visibilmente torbido. Ripetere i passaggi 2,1-2,3 finché un adeguato numero di cellule è visibile nel campo microscopico. Nota: vetrini e coverslips presentano un rischio taglienti. Dopo l'uso, diapositive e coprioggetto sono contaminati con materiale infetto e devono essere smaltite in un contenitore a rischio biologico taglienti. 3. Dattilografia Trasferire ~ 1 ml di inoculo preparato (per esempio utilizzando un ciclo 1 microlitri) sul vetrino per microscopio. Scartare il loop nel contenitore rischio biologico taglienti. Aggiungere un volume equivalente (1 ml un'ansata) di antisiero temperatura ambiente sul vetrino e mescolare entrambe gocce bene con il loop. Usando un paio di pinze, mettere un piccolo vetrino circolare sulla sospensione, facendo attenzione a non toccare la goccia. Posizionare il coprioggetto sulla sospensione immediatamente dopo l'aggiunta di antisieri per evitare che il liquido sul vetrino si secchi. Utilizzando un microscopio, osservare la sospensione sotto a contrasto di fase con ingrandimento 400X. Una reazione negativa Quellung si osserva quando poco o nessun 'gonfiore' delle cellule pneumococco può essere visto a 400X ingrandimento, simile a quello osservato nella sospensione cellulare pneumococcica senza antisieri aggiunto (controllo negativo). Una reazione positiva Quellung si osserva quando le cellule appaiono allargata o 'gonfio' e più visibili rispetto alle celle nel controllo negativo. Nota: reazioni ambigui devono essere studiati ulteriormente, ad esempio esaminando la reazione dopo 5-10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, o ripetendo la reazione con più antisiero. Condurre sierotipizzazione pneumococcica con successiva prova di ogni pool sieri specifici, fino a quando si osserva una reazione positiva. In alternativa, piscine possono essere applicate in «round» a seconda della incidenza locale dei sierotipi. Nota: I test a «turni» assicura che le piscine contenenti anticorpi per i sierotipi più comuni sono testati prima, riducendo al minimo lo sforzo e costo. Sperimentazione contemporanea di diverse piscine fornisce inoltre ulteriori controlli negativi, che può essere utile in interpretation. Se tutte le piscine in un particolare 'round' sono negativi, testare l'isolato con le successive serie di piscine. Testare l'isolato utilizzando il tipo appropriato o gruppo antisiero contenuta all'interno del pool reattiva. Se del caso, utilizzare il fattore antisieri per differenziare ulteriormente il sierotipo. Nota: Chiavi di sieri pneumococcica forniti dal costruttore sono utilizzati per la selezione del pool appropriato, tipo, di gruppo o fattore di sieri e l'interpretazione dei risultati (comprese le eventuali reazioni incrociate). Se i risultati negativi si ottengono con tutte le piscine, testare l'isolato con Omniserum reagente (contiene anticorpi contro 91 sierotipi 21). Se una reazione positiva Quellung non viene ancora osservata nel test di un pneumococcica isolare con il reagente Omniserum, puo essere perché l'isolato esprime poca o nessuna capsula, o che gli anticorpi contro il sierotipo non sono rappresentati nella Omniserum. Quest'ultima categoria può includere nuovi sierotipi. </ Ol>