Capsulaire sérotypage des<em> Streptococcus pneumoniae</em> Utilisation de la réaction Quellung

Une. Préparation de suspension cellulaire pour taper L'utilisation d'un jetable boucle 1 pl stérile, prendre un petit balayage de la nuit fraîche et pure culture de pneumocoques cultivé sur gélose au sang de cheval non sélectif solide et inoculer 100 pi Heart Infusion bouillon (HI). La suspension doit apparaître comme juste visiblement trouble. Agiter doucement le tube pour émulsionner. Remarque: d'autres médias tels que le bouillon Brain Heart Infusion peuvent également convenir. L'addition de sérum (par exemple une concentration finale de 10% (en volume) de sérum / de cheval) et incubation à 37 ° C pendant environ 1 heure avant l'utilisation peut être utilisé pour améliorer la réaction. 2. Contrôle de la densité de suspension cellulaire La suspension de cellules préparée à l'étape 1.1 est également utilisé en tant que témoin négatif, et doit être vérifiée pour la densité des cellules avant d'ajouter les sérums de typage. L'utilisation d'une boucle de 1 ul, transférer une goutte de l'inoculum préparé dans l'étape 1.1 sur un verreglissière de microscope. En utilisant une paire de forceps, placer une petite lamelle circulaire sur la suspension. Utilisation du réglage de contraste de phase, observer la préparation au microscope sous un grossissement de 400X, pour vérifier la densité de la suspension (figure 1A). Si l'inoculum est trop lourde (Figure 2A), ajouter plus de bouillon à la suspension cellulaire effectuée à l'étape 1.1 de la diluer. Mélanger doucement à nouveau. Si l'inoculum est trop clair, par exemple, il ya <50 cellules visibles dans le champ microscopique (figure 2B), ajouter plus de bactéries à la préparation de la suspension cellulaire fait dans l'étape 1.1 et Mélanger doucement. Remarque: Avec l'expérience, la densité de la suspension cellulaire peut être jugé par la secousse et la tenue à la lumière, où il doit apparaître comme juste visiblement trouble. Répéter les étapes 2.1 à 2.3 jusqu'à ce qu'un nombre adéquat de cellules sont visibles dans le champ microscopique. Remarque: les lames de verre et coverslips présentent un danger d'objets tranchants. Après utilisation, les lames et lamelles sont contaminés avec du matériel infectieux et doivent être éliminés dans un récipient biohazard objets tranchants. 3. Dactylographie Transférer ~ 1 ul de l'inoculum préparé (par exemple en utilisant une boucle de 1 ul) sur la lame de microscope en verre. Jeter la boucle dans le récipient biohazard objets tranchants. Ajouter un volume égal (1 pi de anse) de sérum à température ambiante sur la lame et mélanger deux gouttes bien avec la boucle. En utilisant une paire de pinces, placer une petite lamelle circulaire sur la suspension, en prenant soin de ne pas toucher la baisse. Placer la lamelle couvre-objet sur la suspension juste après l'addition d'anti-sérums à empêcher le liquide sur la lame de se dessécher. En utilisant un microscope, observer la suspension sous contraste de phase avec un grossissement de 400X. Une réaction négative Quellung est observée lorsque peu ou pas de «gonflement» des cellules pneumocoque peut être vu à 400X grossissement, similaire à ce qui est observé dans la suspension de cellules pneumococciques avec des antisérums ajouté aucun (témoin négatif). Une réaction Quellung positif est observé lorsque les cellules apparaissent agrandie ou "gonflé" et la plus visible par rapport aux cellules du contrôle négatif. Remarque: les réactions équivoques doivent être étudiés plus loin, par exemple en examinant la réaction au bout de 5 à 10 min d'incubation à température ambiante, ou en répétant la réaction avec le plus d'antisérum. Effectuer sérotypage pneumocoque aux essais successifs de piscines antisérums individuels jusqu'à une réaction positive est observée. Alternativement, des piscines peuvent être appliquées en «cycles» en fonction de l'incidence locale des sérotypes. Remarque: Test en «cycles» veille à ce que les piscines contenant des anticorps pour les sérotypes les plus communs sont testés en premier, en minimisant l'effort et de coût. Essais simultanés de plusieurs piscines fournit également des contrôles négatifs supplémentaires, ce qui peut être utile dans interpretation. Si toutes les piscines dans un «rondes» sont particulièrement négatif, tester l'isolat avec les rondes subséquentes de piscines. Testez l'isolat en utilisant le type approprié ou un groupe anti-sérum contenu dans la piscine réactive. Le cas échéant, utilisez facteur antisérums de différencier davantage le sérotype. Remarque: Les clés de la antisérums pneumocoques fournis par le fabricant sont utilisés dans la sélection de pool approprié, le type, le groupe ou le facteur antisérums et l'interprétation des résultats (y compris les réactions croisées). Si les résultats négatifs sont obtenus avec toutes les piscines, tester l'isolat avec le réactif Omniserum (contient des anticorps contre 91 sérotypes 21). Si une réaction Quellung positif n'est pas encore observé lors de l'essai d'un pneumocoque isoler avec le réactif Omniserum, c'est peut-être parce que l'isolat exprime peu ou pas de capsule, ou que des anticorps contre le sérotype ne sont pas représentés dans le Omniserum. Cette dernière catégorie peut inclure de nouveaux sérotypes. </ Ol>