Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Dit protocol veronderstelt dat de muis kindlin-3 gen (FERMT3) met succes gekloneerd in een vector stroomafwaarts van de zeer late p10 promotor en de vector bezit flankerende baculovirus sequenties recombinatie mogelijk de bacmide BAC10 KO: 1629 ontwikkeld door IM Jones en collega 28. Voor dit protocol, werd de kindlin-3-gen gekloond in pOPINE 29 en de primers en kloneringsstrategie gebruikt kan worden gevonden elders 12 beschreven. Het plasmide is ontworpen zodat de FERMT3 gen (kindlin-3) is onder controle van de p10 baculovirus promoter en de vector bevat 5 'UTR/ORF603 en ORF 1629 en codeert voor een C-terminale His 6-label voor stroomafwaartse zuivering 29. 1. Insect Cel Cultuur en Onderhoud Vóór recombinant baculovirus amplificatie Spodoptera frugiperda cellen aangepast aan suspensiekweek (Sf9-cellen) tegekweekt en gehandhaafd. Insectencellen moet altijd worden behandeld met behulp van aseptische technieken in een speciale weefselkweek zuurkast. Suspensiekweken van insectencellen geïncubeerd in Sf-900 II (SFM) serumvrij vloeibaar medium aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine in kolven bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm. Handhaaf het insect celkweek dichtheid tussen 1 x 06-01 oktober x 10 7 cellen / ml door het splitsen en verdunnen van de celkweek met verse Sf-900 II media. Opmerking: gezonde cellen moeten uniform kijken in grootte en bolvormig moet zijn. Tel de cellen in een monstervolume behulp van een hemocytometer en lichtmicroscopie de cultuur celdichtheid berekend. 2. Generatie van recombinant Baculovirus Cultuur en handhaven Sf9 cellen in suspensie met Sf-900 II medium aangevuld met 100 ug / ml penicillin en 100 ug / ml streptomycine. Voor baculovirus generatie moet insectencellen worden gekweekt tot een dichtheid bereik van 5 x 05-1 oktober x 10 6 cellen / ml. Zaad ongeveer 1 x 10 6 Sf9-cellen per putje van een steriele 6-well weefselkweek plaat in 2 ml Sf-900 II medium aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Laat de Sf9-cellen bij kamertemperatuur in de zuurkast te houden aan de onderkant van de kunststof putjes en vormen een monolaag. Voer recombinant baculovirus generatie door cotransfectie bacmide DNA en plasmide-DNA op monolaagkweek. Voor elke transfectie, meng 1-2 ug gezuiverd pOPINE-mFERMT3, die ORF1629 baculovirus elementen, met 0,5 ug gezuiverd BAC10 KO bezit: 1629 100 pl Sf-900 II SFM zonder antibiotica (oplossing A). In een aparte buis, verdunnen 6 pi Cellfectin II reagens met 100 ul van Sf-900 II SFM zonder antibiotica voor elke transfectie reactie (oplossing B). Een 'master mix' kan hier worden gemaakt, voor minder liquid handling, als er veel transfecties nodig. Meng de twee oplossingen (A en B, ongeveer 200 pl) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min aan een lipide-DNA-complex. Verdun de lipide-DNA complexen met 800 pl Sf-900 II SFM zonder antibiotica. Zuig voorzichtig de Sf9 celmonolaag media en voorzichtig pipet de oplossing A / B en de media op de top van de Sf9 monolaag. Incubeer de getransfecteerde cellen in een bevochtigde incubator bij 27 ° CO / N en voeg nogmaals 1 ml Sf-900 II SFM zonder antibiotica elk monolaagkweek de volgende dag. Incubeer cellen bij 27 ° C nog eens 5 dagen. Oogst de recombinante baculovirus direct uit het kweekmedium (ongeveer 2 ml in totaal) en overbrengen in een schone centrifugebuis (bijvoorbeeld een 15 ml Falcon buis). Verduidelijken welke Sf9 cel Debrwordt door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng het virus, die in het resulterende supernatant en aangeduid P1, een schone buis en bewaar bij 4 ° C in het donker tot gebruik. In dit stadium de resterende Sf9 monolaag kunnen worden gebruikt om recombinante virusproductie evalueren door het bepalen van de aanwezigheid van recombinant kindlin-3 in insectencellen. Resuspendeer de monolaag met 0,5 ml PBS en verdun een 10 ul monster met gelijke volumes 2x SDS-PAGE laadbuffer. Verwarm de monsters bij> 95 ° C gedurende ten minste 10 minuten. Ultrasone trillingen het monster gedurende 1 sec bij 10% amplitude behulp van een micro-sonicator tip als het te stroperig voor een goede gel laden. 3. Amplificatie van recombinant Baculovirus Voor de amplificatie van virus in suspensie, gebruikt een celdichtheid van 1,4 x 10 6 cellen / ml en dit zou bezetten 1/20 van het totale volume kolf (bijvoorbeeld 50 ml cultuureen 2 L kolf). Het bereiken van de amplificatie van het recombinant virus door het infecteren van de insecten celkweek met P1 virale voorraad bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,1 met de volgende formule; Opmerking: P1 virusproductie kan worden aangenomen dat een verwachte virale titer van 1 x 10 7 pfu / ml hebben. Toch kan een plaque assay worden uitgevoerd vóór deze fase. Incubeer de P1-geïnfecteerde insectencellen kweek bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm gedurende 3 dagen (72 uur). Oogst de virus door het scheiden van de cellen van het medium door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de verkregen celpellet in dit stadium bevestiging van recombinante virusproductie door beoordeling kindlin-3-eiwit expressie door SDS-PAGE en western blotting. Breng de geklaarde-virus verrijkte media een schone buis en bewaar bij 4 ° C inhet donker tot gebruik. Deze virale voorraad wordt aangeduid als P2. Opmerking: Een virale titer van 2 x 10 8 pfu / ml (of een versterking van 100 pve / cel) kan worden verwacht. 4. Expressie van kindlin-3 in Baculovirus-geïnfecteerde Sf9 Kweek een voldoende hoeveelheid Sf9-cellen kweken in suspensie in Sf-900 II SFM aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, voor grootschalige recombinante kindlin-3 expressie voor zuivering. Incubeer de suspensie kweken bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm en met een totale kweekvolume: fles volumeverhouding van 01:05. Infect suspensiekweken van Sf9 bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Supplement Sf9 kweken met een eindconcentratie van 1% (v / v) foetaal runderserum (FBS) gevolgd door versterkte recombinant virus (P2-virale stock) een MOI van 1 geven. Incubeer de geïnfecteerde kweken bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm. Oogst recombinatient kindlin-3-CHIS 6-expressie Sf9-cellen 72 uur na infectie door centrifugeren bij 1000 xg   en de resulterende celpellet opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik, of -80 ° C voor lange termijn opslag. 5. Zuivering van recombinant Kindlin-3 Dooi bevroren-baculovirus geïnfecteerde insecten cel (Sf9) pellets die recombinant kindlin-3 op het ijs. Resuspendeer de ontdooide celpellet met lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), aangevuld met EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en 1000-2000 U van DNase1. Opmerking: Als alternatief kan gemodificeerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ook worden gebruikt, wanneer de NaCl-concentratie aangepast tot 500 mM niet-specifieke interacties tussen endogene Sf9 cellen eiwitten en de geïmmobiliseerde metaal affiniteitskolom voor stroomafwaartse zuivering (zie hieronder) te voorkomen. Lyseren de cellen door incubatie van de geresuspendeerde cellen met het wasmiddel en vortexing. Ultrasone trillingen (40% amplitude, 10 cycli van 10 seconden puls gevolgd door 10 seconden afkoeling) het monster voor verdere celdisruptie in een ijsbad of als alternatief een Dounce homogenisator. Verduidelijken het lysaat door centrifugatie bij 48.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Laad het resulterende supernatant op een HisTrap kolom (5 ml kolomvolume), vooraf geëquilibreerd met lysisbuffer, bij 4 ° C met een snelheid van 1 ml / min. Opmerking: Als alternatief kan het geklaarde lysaat worden geïncubeerd met 1-5 ml bedvolume vooraf geëquilibreerd nikkel sepharose korrels (bijvoorbeeld Ni Sepharose 6 Fast Flow) bij 4 ° C gedurende 1-2 uur. Een kolom van Ni Sepharose kan worden gevormd na de bindingsstap door een kolom zwaartekracht. Was de kolom met 10 kolomvolumes wasbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazool) om ongebonden eiwitten te verwijderen. Gebruik een lineaire gradiënt imidazool 10-500 mM met een snelheid van 10 mM / ml (of 10 kolomvolumes) met een AKTA FPLC te eluerende gebonden recombinant kindlin-3-CHIS 6. Fractioneren de elutie in 0,5-1 ml fracties met de Akta FPLC met die fracties die kindlin-3-CHIS 6 gewoonlijk geëlueerd bij een imidazool concentratie van 300 mM. Beoordeel de eiwitsamenstelling van het elutiemiddel door SDS-PAGE en voor eerste zuiveringen bevestigd door Western blotting met anti-His6 antilichaam of anti-muis kindlin-3 antilichaam. Voeg de fracties die kindlin-3 en buffer uitwisseling in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl via een reeks verdunningen in buffer en monsterconcentraties met een centrifugale concentrator eiwit met een 50 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) bij 4 ° C. Opmerking: Als alternatief dialyseer de eiwitoplossing met Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette met een MWCO van 30 kDa bij 4 ° C gedurende 4 uur tot O / N in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl. Opmerking: voor ionenwisseling (zie hieronder) een lagere concentratie van NaCl, <em> ie 50 mm, en is gebruikt voor deze stap. Breng de buffer uitgewisseld eiwitoplossing op een vooraf geëquilibreerd HiTrap heparine HP kolom (5 ml kolomvolume) met een AKTA FPLC met een snelheid van 0,5 ml / min. Opmerking: Het gebonden kindlin-3 wordt geëlueerd met een lineaire NaCl gradiënt (0,2 M NaCl tot 1 M NaCl) in dezelfde buffer verhogen met een snelheid van 10 mM / ml. Kindlin-3-CHIS6 verwacht wordt te elueren bij ongeveer 0,6 M NaCl. Fractioneren de elutie in 0,5-1 ml fracties en de eiwitsamenstelling door SDS-PAGE en western blotting beoordelen, indien van toepassing. Opmerking: men kan een eiwitzuiverheid van bijna 95% verwacht, zoals bepaald door SDS-PAGE. Pool fracties die kindlin-3 en concentraat met een centrifuge concentrator eiwit met een 50 kDa MWCO tot een uiteindelijk volume van 0,5-2 ml. In een laatste stap, polijst de geconcentreerde proteïneoplossing en bufferuitwisseling het eiwit met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). Breng het gezuiverde eiwit op een Superdex S200 (16/60) of (10/30) vooraf geëquilibreerd in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT met een snelheid van 1 ml / min of 0,5 ml / min afhankelijk kolomgrootte gebruikt. Opmerking: Gelpermeatiechromatografie ook in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) worden uitgevoerd indien nodig. Zuiver de eiwitten op grootte door toepassing van buffer op de kolom met een snelheid van 1 ml / min of 0,5 ml / min, afhankelijk kolomgrootte gebruikt. Opmerking: Het eiwit geëlueerd uit de kolom gefractioneerd en gecontroleerd met behulp van de absorptie bij 280 nm. Een absorptiepiek worden verwacht van SEC, die gefractioneerd en beoordeeld door SDS-PAGE om homogeniteit te bepalen, en is typisch> 95% zuiver na deze stap. Concentreer het gezuiverde kindlin-3-CHIS 6 middels een centrifuge concentrator eiwit met een 50 kDa MWCO naar ~ 15 mg / ml, zoals spectrofotometrisch met een berekende extinctiecoëfficiënt (ε) van 109.320 M-1 cm -1 </ Sup> (ervan uitgaande dat alle cysteïne-residuen worden verkleind). Voor opslag bij -20 ° C en lange termijn opslag bij -80 ° C, de hoeveelheid eiwit in PCR buizen en flash-bevriezen de monsters in vloeibare stikstof. Als alternatief kan het eiwit direct worden gebruikt voor onderzoek met een aantal biochemische en biofysische technieken.