Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Bu protokol, bağırsak Peyer yama (PP) in plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) oluşturmak üzere saflaştırılmış hematopoietik progenitörlerin yeteneğini analiz etmek için bir yöntemi göstermektedir. Ortak dendritik hücre progenitörleri (CDP, lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +) FACS ile C57BL6 farelerin kemik iliğinden arıtıldı ve PP önemli bir nüfus pDC eksikliği alıcı farelere transfer edilmiştir, bu durumda, IFNAR / – – fareler transfer alıcı olarak kullanılmıştır. Bazı farelerde, dendritik hücre büyüme faktörü Flt3 ligandı (Flt3L) aşırı ifadesi Flt3L kodlayan plazmidin hidrodinamik gen transferi (hg) kullanılarak, CDP aktarımını EVLAT EDİNEN önce uygulanmıştır. Flt3L aşın transfer (ya da endojen) hematopoietik öncü kaynaklı DC popülasyonları genişler. Projenitör transfer edildikten sonra 7-10 gün sonra, adoptif transfer öncü hücrelerden meydana PDC üzerinde alıcı hücrelerden ayırt edilditransfer CDP + CD45.1 olmak ve alıcıların CD45.2 + olmaktan pDC'lerde ile CD45 işaretleyici ifade, temeli. PP pDC nüfusa katkıda bulunmak ve Flt3L yanıt transfer CDP yeteneği alıcı farelerden PP tek hücre süspansiyonları akış sitometrisi ile değerlendirildi. Bu yöntem, diğer projenitör popülasyonları PDC PP üretme yeteneğine sahip olup olmadığını test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım HGT yoluyla dolaşımdaki sitokinler manipüle ederek varsayılan gelişim faktörü ve / veya uygun bir yere serici, nakavt veya aşın progenitör kümelerine aktararak, PP pDC gelişimini etkilediği tahmin edilmektedir faktörlerin rolünü incelemek için kullanılan olabilir . Bu yöntem aynı zamanda PP PDCS santrallerin diğer bağışıklık altkümelerin frekansını veya fonksiyonlarını nasıl etkilediğini analiz izin verebilir. – / – Fareler, oldukça tüketilmiş PP PDC yabani tip hayvanlara kıyasla, bu nedenle allowi göstermektedir, bu yöntemin benzersiz bir özelliği IFNAR kullanılmasıdıröldürücü radyasyondan sonra karıştırıcı etkilerin yokluğunda PP PDC ng yeniden oluşturma.
Introduction
Burada, biz ortak dendritik hücre atalarıdır (CDP) Peyer yama (PP) de plazmasitoid dendritik hücre (PDC) nüfus sebebiyet verme yeteneğine sahip olup olmadığını değerlendirmek için bir protokol göstermektedir. Bu yöntemi kullanarak genel amacı Peyer yama (PP PDC) içinde pDC'lerde gelişimsel düzenleme değerlendirmektir. Bu önemli bir nedeni, PP PDC kemik iliği, kan ve dalak dahil olmak üzere diğer dokularda bulunan pDC'lerde farklıdır ve bu nedenle PP PDC ve diğer pDC nüfus gelişimsel ve / veya işlevsel olarak ilgili olup olmadığı açık olmasıdır. Özellikle, PDCS yaygın ben Toll-benzeri reseptör 7 ve hızlı IFN salgı 1-3 9 (TLR7 / 9) uyarısına yanıt, hematopoetik sistem içinde (IFN) üreticileri interferon ana türü olduğu için bilinir. Bununla birlikte, PP PDC I TLR agonist uyarma 4,5 'tepki olarak IFN tipi üretiminde eksikliği vardır. Ayrıca, PP PDC aynı zamanda kemik iliğinde ve dalak bulunan pDC'lerde farklılıktüründen sinyallerini gerektiren I (IFN) reseptörü (IFNAR 1) interferon ya da IFN gelişim ve / veya birikim 5 için molekül STAT1 işaret etmektedir. Bu veriler farklı düzenleme mekanizmaları diğer organlarda pDC'lerde karşı PP PDC (örneğin kemik iliği, dalak) kontrol 5 ihtimalini sürmüşlerdir.
Bu yöntemin gelişmesine yol açmıştır gerekçe dendritik hücre (DC) biyoloji anlamada son gelişmeler üzerine dayanıyordu. En önemlisi, hepsi değilse de, alt-gruplar DC FMS benzeri tirozin kinaz 3 reseptörü (Flt3) 6-10 ifade hematopoietik öncü hücrelerden elde, ancak DC gelişme klasik miyeloid ve lemfoid yollar ile sınırlı değildir. Örneğin, Flt3 + ortak miyeloid atalarıdır (CMPS, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FcyR lo / -) CDP (lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +) doğuran, hangih daha pDC'lerde ve konvansiyonel DClerin (CDCS) 9,10 içine ayırt. Buna karşılık, Flt3 + ortak lenfoid progenitorlar (CLPS, lin – IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) pDC'lerde 11 içine öncelikle gelişir. Bu nedenle, önce yapılan çalışmalar, normal analiz kemik iliği, dalak ve / veya kan pDC alt-sınırlı olmasına rağmen PDC, Flt3L düzenlemesi altında, en az 2 ayrı hematopoietik projenitör popülasyonlarından ortaya göstermektedir. Böylece, PP PDCS üretir progenitör nüfus (ler) soruşturma gereklidir. PP pDC'lerde kökenlerini anlamak diğer pDC nüfusa sahip yaygın gelişimsel yolları paylaşmak konusunda ışık tutacak, ya da PP kendi üretimi sırasında farklı mekanizmaları kullanacak.
Burada tarif edilen benzersiz bir yaklaşımın avantajı, hematopoietik progenitörlerin adoptif nakli için alıcılar olarak PP pDC'lerde ciddi bir eksiklik göstermektedir farelerin kullanılmasıdır. Gen sahip olan fareler,gen kodlama tlc silme IFNAR1 (IFNAR – / – fareler) veya STAT1 (STAT1 – / -) PP pDC'lerde 5 çarpıcı bir tükenmesi saptandı. Bu nedenle, bu suşlar adoptif transfer çalışmalar, öldürücü ışıması gibi kuvvetli hücre ablasyon rejimlerin yokluğunda gerçekleştirilebilir sağlayan, PP PDC azalır bir ortam sağlar. Burada sunulan yöntemin bir ek kuvvet Flt3L yükseltilmiş dolaşan miktarlarda teşvik etmek için hidrodinamik gen transferi (hg) kullanılmasıdır. Bu, yeniden birleştirici proteinin püskürtülmesiyle, karşı in vivo Flt3L uyarılması için uygun maliyetli bir yaklaşım sağlar. Laboratuarımızda de dahil olmak üzere çok sayıda çalışma, deneysel koşullar 5,12,13 çeşitli miktarlarda sitokin indükleme Hgt kullanmışlardır.
DClerin için emek ve hassas bağışıklık fonksiyonları bölümü immünoloji büyük ilgi olduğunu. Özellikle, PDC oral tolerans ve sistemik anti-viral önemli aracılarıdırtepkiler, ancak aynı zamanda otoimmün ve kanser 14-17 gelişmesi ve devam etmesi için katkı görünmektedir. Burada açıklanan protokol PP PDCS düzenleyen gelişim mekanizmaları daha tam olarak keşfedilmeyi olmasını sağlayacaktır. Ayrıca, bu yaklaşım çalışmalar PP pDC fonksiyonunu değerlendirmek için izin verebilir, ve santrallerin içindeki diğer bağışıklık nüfus düzenleme ve işlevini anlamak için uzatılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
(- / – Fareler örneğin IFNAR) açıklanan adoptif transfer tekniği, PP pDC'lerde eksikliği olan alıcı farelerde PP pDC nüfusa CDP katkısını değerlendirdik. Gelecekteki deneylerde, bu PP PDCS Flt3 + CLPS türeyen olsun, özellikle PP PDCS üreten diğer öncül altkümelerin potansiyelini değerlendirmek için önemli olacaktır. Bu soru PP PDCS PP tahakkuk 5 için IFNAR'ın-STAT1 sinyallere benzersiz duyarlı neden belirsizliğini korumaktadır öneml…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. Hidrodinamik gen transferi tavsiye Alex Gelbard ve Willem Overwijk. Bu çalışma NIH (AI098099, SSW), Kanser Epigenetik için MD Anderson Merkezi, iltihaplanma ve Kanser için MD Anderson Merkezi (SSW), ve RE Bob Smith Eğitim Fonu (HSL) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referencias
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
