Оценивая развитие мышей плазмацитоидных дендритных клеток в пейеровых бляшках Использование приемных передачи гемопоэтических прародителей
Summary
Этот протокол описывает экспериментальные процедуры для оценки дифференциации плазмацитоидных дендритных клеток в патче Пейера от общих дендритных клеток-предшественников, с использованием методов, связанных с СУИМ-опосредованного выделения клеток, передача гидродинамической гена, и анализ потока иммунных множеств в патче Пейера.
Abstract
Этот протокол детали метод для анализа способность очищенных гемопоэтических клеток-предшественников для создания плазмацитоидных дендритных клеток (PDC) в патче кишечного Пейера (PP). Общие предшественники дендритных клеток (CDPS, Lin – с-Kit ло CD115 + + Flt3) очищали из костного мозга мышей C57BL6 по FACS и переносили в мышей-реципиентов, которые не имеют значительное население PDC в ПП, в этом случае, IFNAR – / – мыши были использованы в качестве получателей переводов. В некоторых мышей, избыточная экспрессия дендритных фактора роста клеток Flt3 лиганда (FLT3L) было приведено в исполнение до приемным передачу ОГТ, используя гидродинамический перенос генов (ХАГАТ) из Flt3L-кодирования плазмиды. Flt3L избыточная экспрессия расширяет населения DC, происходящих из переданных (или эндогенных) кроветворных клеток-предшественников. На 7-10 день после передачи предшественников, PDCS, которые возникают от адаптивно переданных предшественников отличались от клеток-реципиентов наОсновой CD45 маркера выражения, с PDCS от переданные CDPs быть CD45.1 + и получатели быть CD45.2 +. Способность переданных ОГТ внести свой вклад в популяции PDC в ПП и реагировать на FLT3L оценивали с помощью проточной цитометрии ПП одноклеточных суспензий из мышей-реципиентов. Этот метод может быть использован для тестирования, могут ли другие группы населения предшественники способны генерировать PP PDCS. Кроме того, этот подход может быть использован для изучения роли факторов, которые, по прогнозам, влияют PDC развитие в ПП, путем перечисления подмножества предшественников с соответствующим бросовой, нокаутом или избыточной экспрессии предполагаемого фактора развития и / или путем манипулирования циркулирующих цитокинов через тушки . Этот метод также может позволить анализ того, как PP PDCS влияет на частоту или функцию других иммунных подмножеств в ПЗ. Уникальной особенностью этого метода является использование IFNAR – / – мышей, которые показывают сильно истощены ПП PDCS относительно дикого типа животных, таким образом, allowiнг восстановление ПП PDCS при отсутствии мешающих эффектов от летального облучения.
Introduction
Здесь мы демонстрируем протокол оценить, насколько общие дендритных клеток предшественники (ОГТ) способны порождать в плазмацитоидных дендритных клеток (PDC) населения в патче Пейера (PP). Общая цель использования этого метода в том, чтобы оценить регулирование процесса развития как PDCS в патче Пейера (ПП PDCS). Причиной этого является важным является то, ПП PDCS отличаться от PDCS найденных в других тканях, в том числе костного мозга, крови и селезенки, и поэтому неясно, являются ли умственно и / или функционально связаны PP PDCS и других групп населения PDC. В частности, PDCS широко известен как основной тип интерферона (IFN) производители в кроветворной системы, отвечая на Toll-подобный рецептор 7 и 9 (TLR7 / 9) стимуляции быстрого IFN секреции 1-3. Тем не менее, PP PDCS испытывают дефицит в производстве IFN типа I в ответ на TLR агонистом стимуляции 4,5. Кроме того, ПП PDCS также отличаются от PDCS найденных в костном мозге и селезенке втребуя сигналы от типа интерферона (IFN) рецептор (IFNAR1) или ИФН сигнализации STAT1 молекулы для их развития и / или накопления 5. Эти данные предполагают, возможность того, что различные механизмы регулирования управления PP PDCS против PDCS в других органах (например, костного мозга, селезенки) 5.
Обоснование, что привело к развитию этого метода был основан на последних достижениях в понимании дендритных клеток (ДК) биологии. Большинство, если не все, подмножества DC вытекают из гемопоэтических клеток-предшественников, которые экспрессируют FMS-подобной тирозинкиназы рецептора 3 (Flt3) 6-10, однако разработка DC не ограничивается классической миелоидных и лимфоидных путей. Например, Flt3 + идеальные миелоидного предшественники (CMPS, линь – Ил-7R – SCA-1 – с-Kit + CD34 + FcγR вот / -) порождают ОГТ (Lin – с-комплект вот CD115 + Flt3 ·), whicч дальнейшей дифференциации в ЦПК и обычных РС (CDCs) 9,10. Напротив, Flt3 + идеальные предшественники лимфоидных клеток (CLPS, Лин – Ил-7R + SCA-1 вот с-комплект LO) разработать в первую очередь в PDCS 11. Таким образом, предыдущие исследования показали, PDCS возникают, по крайней мере 2 различных гемопоэтических населения предшественников под регулирование FLT3L, хотя типичный анализ был ограничен костного мозга, селезенки и / или PDC крови подмножеств. Таким образом, население (ы) прародитель, который генерирует PP PDCS требуется расследование. Понимание происхождения PP PDCS прольет свет на, разделяют ли они общие пути развития с другими популяциями PDC, или используют разные механизмы во время их генерации в ПП.
Уникальное преимущество подхода, описанного здесь является использование мышей, которые показывают тяжелую недостаточность PP PDCS как получателям на приемных передачи гемопоэтических клеток-предшественников. Мыши с геномкрестики удаление в гене, кодирующем IFNAR1 (IFNAR – / – мыши) или STAT1 (Stat1 – / -) показало поразительное истощение в ПП PDCS 5. Таким образом, эти штаммы обеспечить среду, в которой PP PDCS сокращаются, позволяя приемные исследования передачи должны быть выполнены в отсутствие мощных режимов клеток абляции, таких как летального облучения. Дополнительным Сила метода, изложенного здесь является использование гидродинамического переноса генов (ХАГАТ), чтобы стимулировать повышенный циркулирующие количество FLT3L. Это обеспечивает экономически эффективный подход, чтобы вызвать FLT3L в естественных условиях, по сравнению с инъекцией рекомбинантного белка. Результаты многочисленных исследований, в том числе в нашей лаборатории, использовали ХАГАТ, чтобы вызвать цитокинов суммы в различных экспериментальных условиях 5,12,13.
Разделение труда и точных иммунных функций для РС представляет большой интерес в области иммунологии. В частности, PDCS являются важными медиаторами оральной толерантности и системная противовируснаяответы, но они также, кажется, свой вклад в развитие и настойчивости аутоиммунных и рака 14-17. Протокол, описанный здесь позволит механизмы развития, регулирующие PP PDCS быть более полностью изучены. Кроме того, такой подход может позволить исследования для оценки функции ПП PDC, и может быть продлен до понимания регулирование и функции других иммунных популяций в пределах ПЗ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Техника адоптивный перенос описано здесь оценил вклад ОГТ для населения ПП PDC в мышей-реципиентов, которые дефицитны по ПП PDCS (например IFNAR – / – мышей). В будущих экспериментах, это будет важно оценить потенциал других подмножеств предшественников в создании ПП PDCS, в частности ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора. Алекс Гелбард и Виллем Overwijk за советом о передаче гидродинамического генов. Эта работа была поддержана грантами от NIH (AI098099, SSW), в MD Anderson Центра Рака Epigenetics, в MD Anderson Центра Воспаление и рака (SSW) и РЗ Боб Смит фонда образования (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Referencias
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
