In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles
Summary
Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs (Maroi)-System für die in vivo Quantifizierung einer Fluoreszenzmarkierung von Saposin C (SapC), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles geliefert. Der Einsatz Mausmodellen von Krebs und Arthritis, zeigen wir, wie die Signalkurve Maroi Analyse kann für die genaue Zuordnung und biologische Charakterisierung von Krankheitsprozessen eingesetzt werden.
Abstract
Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs (Maroi)-System für die in vivo-Überwachung von physiopathologischen Prozessen mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist. Mausmodelle (Gehirntumor und Arthritis) wurden verwendet, um die Nützlichkeit dieses Verfahrens zu beurteilen. Saposin C (SapC)-Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles mit CellVue Maroon (CVM) Fluorophor markiert wurden intravenös verabreicht. Die Tiere wurden dann in der Drehhalterung (MARS) des in vivo-Bildgebungssystem angeordnet ist. Die Bilder wurden in 10 °-Schritten über 380 ° erworben. Eine rechteckige Region von Interesse (ROI) wurde über die gesamte Bildbreite auf das Modell Erkrankungsstelle angeordnet. Innerhalb der ROI, und für jedes Bild, mittlere Fluoreszenzintensität wurde nach Subtraktion des Hintergrunds berechnet. In den Mausmodellen untersucht wurden die markierten nanovesicles sich sowohl in den orthotopen und transgene Hirntumoren entnommen und in den arthritischen Stellen (Zehen und Knöchel). Curve Analyse des Multi-Winkel-image ROIs bestimmt den Winkel mit dem höchsten Signal. Somit wird der optimale Winkel für die Abbildung jedes Erkrankungsstelle charakterisiert. Die Bildgebung von fluoreszierenden Verbindungen angewendet Maroi Verfahren ist eine nichtinvasive, wirtschaftlich und präzise Werkzeug für In-vivo-quantitative Analyse der Krankheitszustände, die in den beschriebenen Mausmodellen.
Introduction
Ganze Tierbildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung von Tierarzneimitteltherapie. Unter aktuellen Imaging-Systeme, ermöglicht die MS PRO FX Forscher genau visualisieren fluoreszenzmarkierten (oder lumineszierende)-Verbindungen und / oder Geweben in lebenden Mäusen, und gleichzeitig erhalten Röntgenbilder. Mit der kürzlich eingeführten multimodale Tierrotationssystem (MARS) eine vollständige, automatische Rotation der Maus, um sowohl die fluoreszierenden / lumineszierende und Röntgenbilder in bestimmten Winkeln zu erfassen 1 erreicht. Bildaufnahme kann so programmiert, daß sequentielle Bildfolge kann zu bestimmten, der Zwischenwinkel so klein wie 1 ° erfasst werden. Dies ermöglicht es, die optimale Orientierung des Tieres, dh zu identifizieren. , in dem der Abstand zwischen dem intern erzeugten Fluoreszenz / Lumineszenz-Signal und die Erfassungseinrichtung des Systems ist der kürzeste. Dies wiederum erleichtert die genaue Positionierung des Tieres für die nachfolgende Abbildungs SEssions während Längsschnittstudien.
In diesem Bericht beschreiben wir die Umsetzung einer Multi-Angle-Dreh optische Bildgebung (Maroi)-System zur in vivo Quantifizierung von fluoreszierenden Marker Intensität. Maroi Signalkurvenanalyse kann in Längsschnittstudien für die direkte Korrelation von Fluoreszenzsignalverteilung präzise Karte erkrankten Stellen oder biologische Prozesse von Interesse verwendet werden.
Dieses System wurde verwendet, um die Absorption von fluoreszenzmarkierten SapC-DOPS nanovesicles nach orthotopen und spontane Tumoren zu überwachen, als auch von arthritischen Foci in lebenden Mäusen; vorgesehen, multispektrale und multimodaler Datensätze von kompletten Dreh Deckung der Tiere abgeleitet. Unter den vielen Fluoreszenzsonden derzeit für die in vivo-Bildgebung zur Verfügung, denen emittierenden im nahen Infrarot und fernen roten Spektralbereich verleihen den niedrigsten Interferenz mit der Haut und Gewebe, und stellen die größte Verbreitung und Bild reslösung. Wir verwendeten CellVue Maroon (CVM) 2,3, eine weit rot fluoreszierenden Zell Linker (Ex 647/Em 667), um SapC-DOPS (SapC-DOPS-CVM) 4-12 zu beschriften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die genaue Bestimmung der Lage und Größe von soliden Tumoren und Entzündungsherde bei rheumatischen Bedingungen ist entscheidend für die Umsetzung eine angemessene Behandlung und Follow-up Krankheitsprogression oder Remission. Während wertvolle, aktuelle Bildstrategien (Röntgenstrahlen, MRI, Ultraschall, Röntgen-Computertomographie) liefern unvollständige Bewertung des Krankheitsstatus. Zum Beispiel wird arthritischen Gelenkschäden üblicherweise durch Röntgenstrahlen, die Informationen über die Knochenstruktur, aber nicht auf weichem Gewebe Entzündung und Zerstörung, die charakteristisch für frühe Stadien der Erkrankung liefert bewertet. Die hier vorgestellte Maroi Verfahren verbindet die Vorteile der beiden Röntgenbilder und anspruchsvolle Weichgewebeabbildungsmodalitäten (z. B. MRI oder Ultraschall) in einem integrierten, nicht invasiv und einfacher Plattform, ermöglicht auch eine vollständige 3D-Mapping-und Wiederaufbau des erkrankten Gewebes oder Organs in Kleintiere wie Mäuse.
Diese Methode nutzt die selektive Affinität of SapC-DOPS nanovesicles für exponierte Phosphatidylserin-Reste, die in den Membranen von Krebs und Entzündungszellen reichlich vorhanden sind. Die Determinante dieser Bindung ist SapC eine fusogene lysosomale Protein mit einer starken Affinität für anionische Phospholipide wie Phosphatidylserin 7,10,11. Wenn zu einer Fluoreszenzsonde (CVM) konjugiert sind, können systemisch injiziert SapC-DOPS, Tumor und arthritischen Websites durch Fluoreszenz-Bildgebung verfolgt werden.
Einschränkungen der Methode sind, um die Empfindlichkeit, die derzeit schränkt seine Verwendung zu Abbildung von kleinen Tieren wie Mäusen verwandt. Wie bei anderen bildgebenden Verfahren wird eine optimale Fluoreszenzsignal-Rausch-Verhältnis von der Größe des Tumors oder den Umfang der Arthritis beschränkt und kann bei der Abbildung Geweben oder Organen mit hohen Hintergrund (Autofluoreszenz), wie Nasen (Bildgebung), Darm beeinträchtigt werden / Kot (abdominale Bildgebung) und Pfoten (Hinterbein-Bildgebung). In diesem Zusammenhang haben wir festgestellt, daß ein dunkelrotes Farbstoff wie CVM proVides bessere spektrale Trennung und Auflösung in der in-vivo-Einstellung als die anderen fluoreszierenden Sonden im sichtbaren Bereich.
Weitere Fallstricke sind potenzielle Bewegung des Tieres während der Bildgebung, die beide während der Narkose und post mortem (Rigor mortis). Hinterbein Positionierung, insbesondere ist oft schwierig zu stabilisieren, um eine Bewegung während der Drehung zu vermeiden. Im gegenwärtigen Zustand der Technik ist auch zeitaufwendig, mit Scan-mal so lang wie 60 Minuten benötigt, um eine volle Drehung vollenden und zu erwerben qualitativ hochwertige Bilder.
Die Maroi Verfahren weist eine Anzahl von Vorteilen gegenüber anderen bildgebenden Verfahren. Die Fähigkeit, Bild erkrankte Gewebe ab 38 (oder mehr) unterschiedlichen Winkeln ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenz, die bei der Beurteilung der aus einer einzigen Ebene behindert werden kann; Das ist wertvoll in Tierstudien, weil es kann helfen, die Zahl der falsch-negative, die von der Bildgebung zu unpassenden Winkel führen zu minimieren. Durch overlying Röntgen-und Fluoreszenzbilder kann eine genaue anatomische Lokalisation der erkrankten Stelle bestimmt werden. Schließlich ist die Möglichkeit der Live (in vivo)-Bildgebung ermöglicht Langzeitstudien durchgeführt werden.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH / NCI Grants Anzahl 1R01CA158372-01 (Qi) und New Drug Staat Key Project Grant Number 009ZX09102-205 (Qi) unterstützt. Schreiben Hilfe wurde von Dr. Judy Racadio vorgesehen ist, und wurde von der Universität von Cincinnati Abteilung für Hämatologie und Onkologie finanziert. Vontz Core-Imaging Lab (VCIL) in der Hochschule für Medizin an der Universität von Cincinnati.
Materials
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco (Grand Island, NY) | 11965 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco (Grand Island, NY) | 16000077 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone (Logan, Utah) | SV30010 | |
| Dioleoylphosphatidylserine | Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) | 840035C | |
| CellVue Maroon | Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA) | C-1001 | |
| Sephadex G25 column PD-10 | Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ) | 17-0851-01 | |
| New Standard Stereotaxic for Rats and Mice | Harvard Apparatus (Holliston, MA) | 726335 | |
| Bransonic Ultrasonic Cleaners Model 1510 | Branson Ultrasonics (Danbury,CT) | CPN-952-118 | |
| Multi-spectral FX system | Bruker Corporation (Billerica, MA) | ||
| Multi-angle Rotational Optical Imaging Device | Bruker Corporation (Billerica, MA) |
Referencias
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes. Int J Biomed Imaging. , (2006).
- Gertner-Dardenne, J., et al. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol Invest. 36, 665-685 (2007).
- Qi, X., et al. Functional human saposins expressed in Escherichia coli. Evidence for binding and activation properties of saposins C with acid beta-glucosidase. J Biol Chem. 269, 16746-16753 (1994).
- Wang, Y., Grabowski, G. A., Qi, X. Phospholipid vesicle fusion induced by saposin. C. Arch Biochem Biophys. 415, 43-53 (2003).
- Qi, X., Chu, Z. Fusogenic domain and lysines in saposin. C. Arch Biochem Biophys. 424, 210-218 (2004).
- Qi, X., et al. Cancer-selective targeting and cytotoxicity by liposomal-coupled lysosomal saposin C protein. Clin Cancer Res. 15, 5840-5851 (2009).
- Kaimal, V., et al. Saposin C coupled lipid nanovesicles enable cancer-selective optical and magnetic resonance imaging. Mol Imaging Biol. 13, 886-897 (2011).
- Lu, K., et al. Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines. Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).
- Qi, X., et al. Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity. PLoS One. 7, (2012).
- Abu-Baker, S., Chu, Z., Stevens, A. M., Li, J., Qi, X. Cytotoxicity and selectivity in skin cancer by SapC-DOPS nanovesicles. Journal of Cancer Therapy. 3, 321-326 (2012).
- Wojton, J., et al. Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma. Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).
- Kwon, C. H., et al. Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas. Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).
