Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

La production de protéines antigel (ADP) est un mécanisme de survie important de certains organismes qui vivent dans des environnements chargés de glace. Jusqu’à récemment, on pensait que la seule fonction des ADP était de prévenir ou de ralentir la croissance des cristaux de glace internes qui bloqueraient la circulation, causeraient des lésions tissulaires et un stress osmotique. Les organismes qui ne tolèrent aucun degré de congélation, comme les poissons, expriment des ADP pour inhiber complètement la croissance des cristaux de glace¹. D’autres, comme l’herbe, sont tolérants au gel et expriment des ADP pour inhiber la recristallisation de la glace, ce qui réduit la formation de gros cristaux de glace dans leurs tissus². La stabilisation des membranes à basse température est encore une autre fonction qui a été suggérée pour les AAP^3. Récemment, un nouveau rôle a été suggéré pour l’AFP d’une bactérie antarctique, Marinomonas primoryensis, provenant de lacs saumâtres recouverts de glace⁴. Cet AFP fait partie d’une protéine adhésine⁵ beaucoup plus grande qui est censée attacher la bactérie à la glace pour un meilleur accès à l’oxygène et aux nutriments⁶. D’autres microbes sont connus pour sécréter des ADP, ce qui pourrait modifier la structure de la glace dans laquelle ils vivent⁷.

Des ADP ont été trouvés chez certains poissons, insectes, plantes, algues, bactéries, diatomées et champignons. Ils ont des séquences et des structures remarquablement divergentes compatibles avec leur évolution à partir de différents progéniteurs à diverses occasions; et pourtant ils se lient tous à la glace et inhibent sa croissance par le mécanisme d’adsorption-inhibition⁸. Les AAP ont chacun une surface spécifique qui agit comme son site de liaison aux glaces (SII). Ceux-ci ont généralement été identifiés par mutagenèse dirigée vers le site des résidus de surface^9-11. On présume que l’IBS dispose les molécules d’eau selon un motif semblable à celui de la glace qui correspond à des plans de glace spécifiques. Ainsi l’AFP forme son ligand avant de s’y lier^{5, 12.} Les plans de glace peuvent être définis par leurs indices de Miller, et différents AAP peuvent se lier à différents plans. Ainsi, l’AFP de type I de la plie rouge se lie aux 20-21 plans pyramidaux^13,l’AFP de type III lie à la fois le prisme primaire et le plan pyramidal à l’aide d’une surface de liaison à la glace composée^11,14, tandis que la tordeuse des bourgeons de l’épinette AFP, une AFP hyperactive, se lie simultanément aux plans primaire et basal^15,16. D’autres AFP hyperactifs, tels que mpAFP, se lient à plusieurs avions de glace comme le montre leur couverture complète des hémisphères de cristal de glace simples^5,17. On le présume, que la capacité des AAP hyperactifs à lier le plan basal, ainsi que d’autres plans, peut expliquer leur activité 10 fois plus élevée que les AOP modérément actifs¹⁸. Bien que l’efficacité des ADP hyperactifs soit bien documentée, leur capacité à se lier à plusieurs avions de glace n’est toujours pas comprise.

La méthode originale pour déterminer les avions de glace à destination de l’AFP a été développée par Charles Knight^13,19. Dans cette méthode, un cristal de glace unique macroscopique est monté sur une tige métallique creuse (doigt froid) et formé dans un hémisphère en le submergeant dans une tasse hémisphérique remplie d’eau dégazée. Ensuite, l’hémisphère est immergé dans une solution diluée d’AFP et une couche de glace est cultivée à partir de la solution AFP sur l’hémisphère cristallin de glace pendant plusieurs heures contrôlées par la température de l’éthylène glycol circulant à travers le doigt froid. Le cristal de glace est retiré de la solution, détaché du doigt froid et placé dans une salle de congélation de -10 à -15 °C. La surface est grattée avec une lame tranchante pour éliminer le film de surface congelé de la solution protéique antigel et le cristal de glace est laissé sublimer pendant au moins 3 heures. Après sublimation, les plans de glace liés par les AFFA peuvent être vus comme des motifs gravés blancs dérivés de protéines résiduelles. L’hémisphère de glace peut être orienté vers ses axes cet a,pour localiser les plans basal et prisme de la glace, et déterminer les indices de Miller des taches gravées.

Nous décrivons ici une modification de la méthode originale de détermination des plans de glace liés à l’AFP, une méthode que nous appelons affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence^11. Les AFP sont marqués par fluorescence soit avec une étiquette chimérique, telle que la protéine fluorescente verte (GFP)^11,16,17,20,soit avec un colorant fluorescent lié de manière covalente à l’AFP^5,21. Les ADP marqués par fluorescence sont adsorbés sur un seul cristal de glace et envahis par la prolifération en utilisant la même procédure expérimentale que les expériences originales de gravure sur glace. L’étendue de la liaison de l’AFP à l’hémisphère de glace en croissance peut être surveillée tout au long de l’expérience à l’aide d’une lampe ultraviolette (UV). Une fois l’expérience terminée, l’hémisphère peut être directement retiré du doigt froid et ességé, sans sublimation. Cependant, si vous le souhaitez, l’hémisphère peut être laissé à sublimer pour visualiser une gravure sur glace traditionnelle. Les modifications apportées à la méthodologie de l’APIE raccourcissent de plusieurs heures le protocole traditionnel de gravure sur glace. De plus, il est possible d’imager simultanément plusieurs AFP, chacun avec une étiquette fluorescente différente, pour visualiser les modèles qui se chevauchent des plans de glace liés à l’AFP.