通过荧光基冰平面亲和力确定防冻蛋白的冰结合平面

抗冻蛋白（AFPs）的产生是生活在冰层中环境中的一些生物体的重要生存机制。直到最近，人们还认为AFP的唯一功能是防止或减缓内部冰晶的生长，这些冰晶会阻断循环，造成组织损伤和渗透应激。不能容忍任何程度的冰冻的生物，如鱼，表达AFP，以完全抑制冰晶生长^1。其他，如草，是耐冻和表达AFP，以抑制冰的再封装，减少形成大冰晶在他们的组织^2。在低温下稳定膜是另一个功能，建议为AFP³。最近，一个新的角色被建议为法新社的南极细菌， 马里诺莫纳斯原始，从冰覆盖的咸水湖^4。这个AFP是一个更大的粘合蛋白⁵的一部分，被认为是附加细菌到冰上，以更好地获得氧气和营养^物质6。其他微生物已知分泌AFP，这可能改变它们生活⁷的冰的结构。

在一些鱼类、昆虫、植物、藻类、细菌、硅藻和真菌中发现了AFP。它们具有显著不同的序列和结构，与不同祖先在不同场合的进化相一致：然而，它们都与冰结合，并通过吸附抑制机制⁸抑制其生长。AFP各有一个特定的表面，作为其冰结合点（IBS）。这些通常通过^9-11表面残留物的现场定向突变来识别。IBS 假设将水分子排列在与特定冰平面相匹配的冰样图案中。因此，法新社形成其配体之前，绑定到它^5，12。冰飞机可以通过米勒指数来定义，不同的AFP可以与不同的平面结合。因此，I型法新社从冬季比目鱼绑定到20-21金字塔平面^13，III型法新社结合主棱镜和金字塔平面使用复合冰结合表面^11，14，而云杉芽虫法新社，一个过度活跃的法新社，同时结合到主平面和基底平面^15，16。其他过度活跃的AFP，如 MpAFP，与多个冰平面结合，如它们对单个冰晶半球^5，17的完全覆盖所示。据推测，超活性AFP结合基底平面和其他飞机的能力，可能占其活性的10倍，比适度活跃的AFP^18。虽然超活性AFP的效率是有据可查的，但它们与多个冰层结合的能力仍然不为人所知。

确定法新社飞往冰上飞机的最初方法是由查尔斯·奈特^{13，19开发的}。在这种方法中，一个宏观的单一冰晶被安装在一个空心金属棒（冷手指）上，通过将其浸入装满脱气水的半球杯中形成半球。然后，半球被淹没在AFP的稀释溶液中，在几个小时内，由通过冷手指循环的乙二醇温度控制，从法新社溶液中长出一层冰到冰晶半球。冰晶从溶液中取出，从冷手指上分离出来，放置在-10至-15°C的冰柜室中。表面用锋利的刀片刮去防冻蛋白溶液的冷冻表面薄膜，冰晶允许升华至少3小时。升华后，由AFP绑定的冰平面可视为从残余蛋白质中提取的白色蚀刻图案。冰半球可以定向到其 c轴和 斧头，定位冰的基础平面和棱镜平面，并确定蚀刻补丁的米勒指数。

在这里，我们描述了对确定法新社绑定冰平面的原始方法的修改，我们称之为荧光基冰平面亲和力^{（FIPA）11。}AFP 的荧光标记要么带有钟音标签，如绿色荧光蛋白 （GFP）^{11，16，17，20，}要么与荧光染料共价绑定到 AFP^5，21。荧光标记的AFP被吸收到一个冰晶中，并且使用与原始冰蚀实验相同的实验程序过度生长。在整个实验中，可以使用紫外线（UV）灯监测与生长的冰半球结合的AFP的程度。实验完成后，半球可以直接从冷手指上取下并成像，无需升华。然而，如果需要，半球可以留给升华，以可视化传统的冰蚀刻。对FIPA方法的修改将传统的冰蚀协议缩短了几个小时。此外，还有可能同时成像几个具有不同荧光标签的 AFP，以可视化 AFP 绑定冰平面的重叠模式。