Sorteren van<em> Streptomyces</em> Cel Pellets behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter
Summary
-Vloeibare gegroeid Streptomyces culturen worden gekenmerkt door mycelium pellets die heterogeen zijn in omvang. We beschrijven hier een werkwijze voor het analyseren en sorteren dergelijke pellets in een high-throughput manier. Deze pellets kunnen worden gebruikt voor verdere analyse, die leidt zal begrijpen en te beheersen groei heterogeniteit.
Abstract
Streptomyceten zijn filamenteuze bodembacteriën die worden gebruikt in de industrie voor de productie van enzymen en antibiotica. Wanneer gekweekt in bioreactoren, deze organismen vormen netwerken onderling verbonden hyfen, zogenaamde pellets, die heterogeen zijn in grootte. Hier beschrijven we een methode om te analyseren en te sorteren mycelium pellets met behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter (COPAS). Gedetailleerde instructies worden gegeven voor het gebruik van het instrument en de elementaire statistische analyse van de gegevens. We bovendien beschrijven hoe pellets kunnen worden gesorteerd volgens de gebruiker gedefinieerde instellingen, die downstream processing mogelijk maakt zoals de analyse van het RNA of eiwit gehalte. Met behulp van deze methode het mechanisme onderliggende heterogene groei kan worden aangepakt. Deze elementen zullen verbeteren streptomyceten als een mobiele fabriek, gezien het feit dat de productiviteit correleert met korrel grootte.
Introduction
Streptomyceten zijn filamenteuze bodembacteriën die bekend staan om hun vaardigheid om antibiotica te maken, alsmede verbindingen die kunnen worden gebruikt als immunosuppressiva of schimmelinfecties of kanker 1,2 bestrijden. Bovendien zijn deze organismen produceren enzymen die van belang zijn voor een groot aantal industriële toepassingen 3. De meeste commercieel interessante verbindingen worden geproduceerd in bioreactoren. Ontwikkeling van streptomyceten in bioreactoren wordt gekenmerkt door de vorming van complexe structuren van onderling verbonden hyfen, bekend als klonten of pellets. Deze meercellige structuren zijn zeer heterogeen met betrekking tot maat 4 en kan maten die meer dan een miljoen keer groter dan een eencellige bacterie zoals Escherichia coli of Bacillus subtilis bereiken. Hoewel heterogeniteit als uiteindelijk eigenschap in natuurlijke biologische systemen 5, wordt het beschouwd als een productie valkuil industrie. Bioreactor teelten zijn reproduceerbaar en controleerbaar hoog mogelijke opbrengst te verkrijgen. Het begrijpen van de rol van elk van de pellet types in een bioreactor is daarom van cruciaal belang streptomyceten als celfabriek verbeteren.
Flowcytometrie wordt vaak gebruikt om individuele cellen te analyseren in een populatie 6. Flowcytometers kan multiparametrische informatie te verkrijgen door het gelijktijdig meten van eigenschappen van de cellen (zoals grootte, dichtheid en multicolor fluorescentie). Zo kan celeigenschappen worden gecorreleerd waardoor wordt bijgedragen aan ons begrip van heterogeniteit binnen een cultuur en het bestaan van verschillende populaties van cellen 6. Meer gespecialiseerde instrumenten hebben het mogelijk om cellen te sorteren door de gebruiker gedefinieerde parameters. Zo kunnen mutanten worden gescreend. Na sortering, kunnen dergelijke mutant cellen worden gekweekt voor verdere karakterisering. Dit heeft al bewezen nuttig te zijn, onder andere,productiviteit van stammen 7,8 verbeteren. De mondstukken van flowcytometers typisch voor het passeren van cellen met een maximale diameter van ongeveer 10 urn. Daarom kan pellets van streptomyceten niet worden geanalyseerd met regelmatige flowcytometers. Zij, echter, kan worden geanalyseerd met de Complexe Object Parametric Analyzer en Sorter (COPAS). Als gewone flowcytometers, kan COPAS Multiparametrische gegevens van deeltjes in een high throughput manier te verwerven. Afhankelijk van het type COPAS 10-1,500 urn deeltjes kunnen worden geanalyseerd. Bovendien maakt het sorteren van afzonderlijke deeltjes die kunnen worden gebruikt voor de kweek of stroomafwaarts analyses, zoals de isolatie van DNA, RNA of eiwitten. COPAS was oorspronkelijk ontworpen voor de analyse en sortering van kleine meercellige organismen, zoals de nematode Caenorhabditis elegans 9 es Drosophila embryo's en larven 10. De instrumenten zijn ook gebruikt voor 11 een zebravisnd voor draadschimmels 12,13. Deze organismen vormen ook mycelium pellets die nog groter is dan die gevormd door filamenteuze bacteriën. We hebben onlangs aangetoond dat het gebruik van COPAS is ook mogelijk voor streptomyceten 4. We beschrijven hier de experimentele procedure voor het gebruik van de COPAS om pellet heterogeniteit beoordelen Streptomyces coelicolor, met inbegrip van bijzonderheden over de methodiek om pellets te sorteren op grootte. Let wel, dat deze werkwijze ook kan worden gebruikt voor de analyse van andere pellet vormende streptomyceten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flowcytometrie is de snelle analyse van grote aantallen van enkele cellen, die klonale populaties 6 bijgedragen aan ons begrip van heterogeniteit ingeschakeld. Regelmatig flowcytometrie is niet haalbaar voor analyse van de meercellige mycelium pellets van streptomyceten en schimmels. Ons werk heeft aangetoond dat high-throughput analyse van Streptomyces pellets is haalbaar met behulp COPAS. De hier beschreven procedure is eenvoudig, snel, en zeer reproduceerbaar. De kritische parameter in gedachten te houden tijdens het gebruik van het instrument is de stroomsnelheid, die niet hoger mag zijn dan 100 events / sec (stap 3.8 van dit protocol). Indien de pellet concentratie, en dus ook de stroomsnelheid, te hoog wordt, zal de TOF waarden berekend waren omdat het instrument niet aan individuele korrels detecteren. Voldoende verdunnen van het monster door de toevoeging van PBS ondervangt dit probleem.
Beperkingen
De COPAS Plus gebruik d heeft hier een spuitmond diameter van 1 mm, die geschikt is voor het meten van deeltjes met een grootte variërend 30-700 urn. Dit mondstuk maakt daarom meten pellets gevormd door streptomyceten. Voor filamenteuze schimmels kan het micro-kolonies groter zijn, wat de algemene toepasbaarheid van de COPAS Plus beperkt. De COPAS XL deeltjes kan meten tot 1500 urn in grootte maar de gevoeligheid in het onderste bereik van diameter kleiner vergeleken met die van de COPAS Plus. Zowel de COPAS Plus en de COPAS XL kan niet deeltjes kleiner dan 30 micrometer te analyseren. Dit betekent dat individuele microbiële sporen of cellen niet kunnen worden geanalyseerd. Bovendien kan de COPAS niet nauwkeurig te analyseren kleine aggregaten van cellen of sporen en de zeer kleine micro-kolonies. Voor deze, moet gewone mobiele analysers worden gebruikt. Deze beperking wordt overwonnen door de Biosorter van Union Biometrica, welke deeltjes kan analyseren in het bereik van 1-1,500 urn. De aankoop prijs is echter hoger.
De COPAS is een robuust instrument is eenvoudig te bedienen. Echter, soms pellets worden niet gedetecteerd na het laden van een monster in de steekproef beker en het starten van de meting. De oorzaak is typisch een verstopte ingang buis, die gemakkelijk kan worden opgelost door de 'schone' commando. Dit zal de pellets terug uit de slang systeem dwingen in het monster beker. Een andere reden kan zijn dat het deksel niet correct in de monsterhouder geplaatst. Dit leidt tot drukverlies en gelijktijdig niet-pellets detecteren.
Betekenis en toekomstige richtingen
Wij hier gericht op de analyse van korrelgrootte maar de COPAS setup is ook in staat om te analyseren en te sorteren op basis van fluorescentie en dichtheid. Fluorescentiedetectie kunnen wij genexpressie op basis reporters zoals GFP geanalyseerd. Verder kan de samenstelling van cellen geëvalueerd. Nog krachtiger is de mogelijkheid om pellets te scheiden volgens deze parametersters. Gesorteerd pellets kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyses inclusief alle omica studies. Inderdaad, wij eerder gesorteerd 60.000 grote en 200.000 kleine pellets, en toonde aan dat het proteoom was significant verschillend tussen grote en kleine pellets 4. Deze technologie biedt daarom nieuwe leads te streptomyceten als celfabrieken verbeteren.
Het belangrijkste voordeel van de COPAS technologie is tijd. Eerdere studies op celpellets werden uitgevoerd microscopische en beperkt dit het aantal korrels die kan worden geanalyseerd om honderden 16. Microscopie studies reeds gesuggereerd dat er twee populaties pellets in vloeibare kweken gekweekt Streptomyces 16. Inderdaad, twee populaties pellets werden gedetecteerd ongeacht kweekomstandigheden in een groot aantal verschillende streptomyceten 4. Deze maat heterogeniteit is niet beperkt tot draadvormige streptomyceten, maar werd ook waargenomen in filamenteuze schimmels 12 </ Sup>. In alle gevallen zijn de onderliggende mechanismen van heterogeniteit nog niet bekend. De mogelijkheid om pellets te sorteren op grootte en fluorescentie stelt ons in staat om dergelijke mechanismen te ontrafelen.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
Referencias
- Hopwood, D. A. . Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).
- van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
- Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
- van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
- Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
- Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
- Pulak, R., Strange, K. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genética. 175, 1505-1531 (2007).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
- van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. . Practical Streptomyces Genetics. , (2000).
- Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
- Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).
