말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

1) 레이저 포획 미세 절에 대한 폴리텐 염색체 슬라이드 준비 25 시간 후 혈액 먹이에서 반 중력 Anopheles 여성을 해부. 난소를 약 5마리의 암컷에서 500μl으로 수정하여 24시간 동안 실온에서 신선한 변형 카노이용(100% 메탄올: 빙하 아세트산, 3:1)으로 수정합니다. 장기 저장을 위해 난소를 -20°C로 옮깁니다. 염색체 슬라이드를 만들기 직전에 Carnoy의 용액 (100 % 에탄올 : 빙하 아세트산, 3 :1) 및 50 % 프로피오닉 산을 준비하십시오. 자이스 1.0 PET 멤브레인 슬라이드에 카노이의 용액 한 방울에 난소 한 쌍을 놓습니다. 크기에 따라 난소를 해부 바늘로 약 2-4 부분으로 분할하고 해부 현미경의 밑에 깨끗한 슬라이드에 50% 프로피온산을 떨어뜨립니다. 여포를 분리하고 해부 스테레오 현미경의 밑에 종이 타월을 사용하여 남은 조직을 제거하십시오. 여포에 50%의 프로피온산을 새로 넣고 실온에서 3-5분 동안 앉을 수 있도록 합니다. 실리콘 커버슬립을 물방울 위에 놓습니다. 슬라이드를 약 1분 동안 방치하십시오. 흡수성 재료로 슬라이드를 덮고(필터 용지는 이 방법에 사용됨) 연필의 지우개 면을 사용하는 동안 지우개로 반복적으로 눌러 커버슬립에 넉넉한 양의 압력을 가합니다. 슬라이드 를 60°C로 가열하여 슬라이드 데노션/혼성화 시스템에서 15-20분 동안 가열하여 폴리텐 염색체를 평평하게 합니다. 산이 염색체를 더 평평하게 할 수 있도록 밤새 4 °C의 습한 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드를 차가운 50% 에탄올에 10분 동안 놓습니다. 커버슬립을 부드럽게 제거하고, 차가운 50% 에탄올로 10분 이상 교체합니다. 탈수 슬라이드는 각각 70%, 90%, 100% 에탄올을 5분 동안 미끄러. 공기 건조 슬라이드. 단일 버퍼 태블릿을 증류수 1L에 추가하여 GURR 버퍼 솔루션 의 솔루션을 준비합니다. 오토 클레이 브. Giemsa 염색 용액 1ml를 GURR 버퍼 50ml에 추가하여 지임사 용액을 준비합니다. 기임사 용액에 공기 건조 슬라이드를 10분 동안 놓고 1X PBS로 3회 세척합니다. 오염을 피하기 위해 제어된 멸균 기후에서 공기 건조가 다시 미끄러지게 됩니다. 2) 레이저 캡처 단일 폴리텐 염색체 암의 미세 절 이 섹션에서는 PALM MicroBeam 레이저 미세 절제 시스템과 함께 제공되는 PALMRobo 소프트웨어의 사용을 자세히 설명합니다. 100 % 에탄올로 현미경을 청소하십시오. UV 크로스링커에 자외선으로 장갑과 튜브를 살균합니다. PALM MicroBeam 레이저 미세 절 현미경을 전원을 공급하고 레이저를 켭니다. 레이저 해부 제품군인 PALMRobo를 열고 필요에 따라 “전원” 및 “포커스” 설정을 구성합니다. 관심의 폴리텐 염색체 팔을 검색합니다. “연필” 도구를 사용하여 선택한 영역의 윤곽을 그립니다. 메뉴 모음에서 “요소 창”을 엽니다. “그려진 요소”를 선택하여 “잘라내기”를 선택했습니까? 접착제 캡 튜브를 홀더에 설치하고 슬라이드 위에 배치하여 작은 간격< 크기 < 레이저 컷을 시작합니다. 잘라내기 부위 내에 “투석기 선택”을 배치하여 가장자리와 염색체 사이에 공간을 남깁니다. 드롭다운 옵션에서 “LPC”를 선택하고 발사를 시작합니다. “눈” 아이콘을 눌러 샘플이 캡으로 발사되었는지 확인합니다. 3) 단일 미세 한 제다색 염색체 팔에서 DNA의 정제 QIAamp DNA 마이크로 키트의 지시에 따라 수집된 DNA를 방출하고 정화합니다. 3.1 단계는 반전 된 튜브를 수용하기 위해 수정되었습니다. 15 μl 버퍼 ATL과 10 μl 단백질Ae K를 반전 된 튜브 (캡 내부)에 넣고 3 시간 동안 56 °C에서 배양하십시오. 25 μl 버퍼 ATL, 50 μl 버퍼 AL 및 1 μl 캐리어 RNA를 추가; 혼합. 50 μl 100 % EtOH를 추가하십시오. 섞다. 리세이트를 QIAamp 열로 전송; 원심 분리기. 500 μl 버퍼 AW1을 추가하여 세척; 원심 분리기. 열을 새 수집 튜브에 넣고 500 μl 버퍼 AW2를 추가합니다. 원심 분리기. 열을 새 튜브에 넣습니다. 원심 분리기는 과도한 액체를 제거합니다. 컬럼을 1.5 μl 마이크로센심분리기 튜브에 넣고 20 μl의 물을 엘루트에 넣습니다. 원심 분리기. 진공분리기를 사용하여 갓 발동된 DNA를 9 μl의 최종 부피로 증발시다. 4) 단일 미세 한 다분색 염색체 팔에서 DNA의 증폭 단일 염색체 암의 WGA에 두 개의 서로 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 게놈플렉스 WGA를 통한 DNA 증폭 및 프로브 제제 게놈플렉스 단일 세포 WGA4 키트 프로토콜을 따라 증폭된 DNA의 첫 번째 배치를 생성합니다. 9 μl 샘플에 갓 준비된 Proteinase K 용액을 추가합니다. 혼합. 1 시간 동안 50 °C에서 DNA를 인큐베이션 한 다음 4 분 동안 99 °C로 가열합니다. 얼음을 유지합니다. 2 μl 1X 단일 셀 라이브러리 준비 버퍼 및 라이브러리 안정화 솔루션의 1 μl을 추가; 혼합. 2 분 동안 95 °C로 샘플을 가열합니다. 얼음과 원심분리기를 식힙니다. 도서관 준비 효소 의 1 μl을 추가; 혼합 및 원심 분리기. 다음과 같이 인큐베이터: 7.5 μl 10X 증폭 마스터 믹스, 48.5 μl 물을 추가합니다. 5.0 μl WGA DNA 폴리머라제; 혼합 및 원심 분리기. 다음과 같이 열주기: 유전체 DNA 클린 및 농축기 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다. 프로토콜은 다음과 같습니다. 추가 5:1 DNA 바인딩 버퍼: DNA 샘플 (특히 2 kb 미만의 게놈 DNA용. 샘플 DNA가 2kb보다 큰 경우 2:1 비율을 사용하고 제공된 스핀 컬럼으로 옮김합니다. 원심 분리기. 200 μl DNA 세척 버퍼와 원심분리기를 추가합니다. 반복 세척 단계. 그런 다음 50 μl의 물을 추가하고 DNA를 새로운 1.5 ml 튜브에 넣습니다. 다음과 같이 GenomePlex WGA3 증폭 키트를 사용하여 샘플 DNA를 다시 증폭시하십시오. PCR 튜브에 10 μl DNA를 추가 (키트는 DNA의 10 ng 총을 권장) 49.5 μl 물, 7.5 μl 10x 증폭 마스터 믹스, 3.0 μl 10 mMM DNTP 믹스, 5.0 μl WGA DNA 폴리머 라제. 혼합 및 원심분리기. 반응에 대해 다음 프로필을 사용합니다. -20°C에 DNA를 저장합니다. 다음과 같이 게놈플렉스 WGA3 증폭 키트를 사용하여 물고기에 대한 라벨 DNA: 49.5 μl 물로 PCR 튜브에 10 μl DNA를 추가하여 GenomePlex WGA3 리앰프 키트에서 마스터 믹스를 만들고, 7.5 μl 10X 증폭 마스터 믹스, 3.0 μl 1 mM dNTP 믹스 (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0.3 μl 1 mM dTTP – 라벨이 붙은 dUTP를 사용하는 경우), 25 nM 라벨 dUTP의 1 μl , 및 5.0 μl WGA DNA 폴리머라제. 반응에 대해 다음 프로필을 사용합니다. 에탄올은 3M 아세테이트 pH 5.2 및 100% 에탄올의 2-3부피의 최종 반응 부피(75 μl 반응에 대한 7.5 μl)를 1/10을 추가하여 표지된 프로브를 침전시한다. 적어도 30 분 동안 -80 °C에서 DNA 샘플을 냉각하십시오. 4°C에서 10분 동안 원심분리기 샘플을 시료하여 라벨이 부착된 펠릿을 만들고 상설 및 공기 건조 펠릿을 제거합니다. 다음과 같이 하이브리드화 버퍼 만들기:0.2 g 도스네 황산염1200 μl 디온화 폼아미드580 μl H2O120 μl 20X SSC 40 μl의 혼성화 버퍼를 공기 건조 펠릿에 추가합니다. REPLI-G 단일 세포 WGA를 통한 DNA 증폭 및 프로브 제제 및 닉 번역 증폭된 DNA를 생성하기 위하여 REPLI-g 단하나 세포 WGA 키트 프로토콜을 따르십시오: 버퍼 D2(1M DTT의 3μl + 33 μl 버퍼 DLB)를 준비합니다. 정제된 미세 한 정제 물질의 4 μl을 3 μl 버퍼 D2와 혼합합니다. 혼합 플릭 튜브. 65 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 정지 용액의 3 μl을 추가합니다. 섞다. 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g 반응 버퍼, 및 2 μl의 REPLI-g DNA 폴리머라제를 샘플에 추가합니다. 30°C에서 8시간 동안 배양합니다. 3 분 동안 65 °C로 가열하여 DNA 폴리머라아제비활성화. -20°C에 DNA를 저장합니다. REPLI-g 증폭 DNA를 레이블닉 번역 프로토콜을 따르십시오. 다음 라벨링 믹스를 준비합니다.증폭된 DNA 1μg5 μl 10X DNA 폴리머라제 버퍼5 μl 10X dNTP5 μl 1X BSA1 μl 1 mM 라벨 dNTP4 μl 1 U/μl DNase I1 μl 10 U/μl DNA 폴리머라제 IH2O ~ 50 μl 2 시간 동안 15 °C에서 배양하십시오. 반응을 멈추려면 0.5 M EDTA의 2 μl을 추가합니다. 젤에서 실행하여 DNA 조각 크기를 확인합니다. 4.1.4.3-4.1.4.6에서 단계 수행하여 펠릿을 침전시키고 용해합니다. 5) 폴리텐과 미토성 염색체 스쿼시 제제에 2D FISH 폴리텐 스쿼시 (47)와 미토성 염색체 슬라이드 (48)의준비에 FISH에 대한 자세한 프로토콜을 참조하십시오. 여기서 우리는 간단한 프로토콜을 제공합니다. 폴리텐 염색체 스쿼시 제제에 물고기 1X PBS에서 20분 동안 1X PBS로 슬라이드를 1분 동안 1X PBS로 4% 파라포름알데히드로 슬라이드합니다. 탈수 슬라이드는 에탄올 세초를 통해 슬라이드 : RT. 공기 건조 슬라이드에서 각각 50 %, 70 %, 90 %, 100 % 100 % 37°C에서 혼성화 버퍼에서 프로브를 예열합니다. 10-20 μl의 프로브를 추가하여 슬라이드합니다. 커버 22 X 22 mm 커버 슬립. 파이펫 팁을 사용하여 기포를 누릅니다. 10 분 동안 90 °C에서 염색체 및 프로브를 변성합니다. 고무 시멘트로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 슬라이드를 습한 챔버로 옮기고 하룻밤 사이에 39°C에서 배양합니다. 슬라이드를 39°C에서 1X SSC로 20분 동안 세척합니다. 20 분 동안 RT에서 1X SSC로 슬라이드를 씻으십시오. 1X PBS에서 슬라이드를 헹구고 DAPI로 페이드 방지 연장을 추가합니다. 커버슬립으로 덮고, 시각화 전에 적어도 한 시간 동안 4°C의 슬라이드 박스에 보관하십시오. 미토성 염색체 스쿼시 제제에 대한 물고기 안감비아의4번째 인스타 애벌레의 상상디스크로부터 미토성 염색체를 추출한다. FISH에 적합한 염색체 슬라이드를 준비합니다. 라벨이 부착된 DNA 프로브의 2-3 μl을 튜브의 혼성화 버퍼에 넣고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 프로브 혼합물의 10 μl을 슬라이드에 바르고 22 X 22mm 커버슬립으로 덮습니다. 파이펫 팁을 사용하여 기포를 누릅니다. 카운터스테인링 및 검출을 위해 DAPI를 사용하여 페이드 방지 연장을 준비에 적용하고 시각화하기 전에 적어도 한 시간 동안 어둡게 유지하십시오. 6) 전체 마운트 난소 조직에 3D 물고기 다음 버퍼 A 믹스를 준비합니다.60mM KCl15 mM NaCl0.5 mM 스미디딘0.15 mM 스퍼마인2mM EDTA0.5 mM EGTA15m 파이프 커버립의 크기에 맞게 정사각형 패턴에 매니큐어 레이어를 추가하여 핵 시각화슬라이드를 준비합니다. 이것은 미래에 커버 슬립에 배치 할 때 핵의 분쇄를 방지하기 위해 제기 표면을 만듭니다. 크리스토퍼의 단계 3 여성에서 신선한 난소를 해부하고 0.5 %의 디지토닌150-250 μl 버퍼 A의 용액에 보관하십시오. 여포 보다 더 큰 해부 바늘을 실행 (0.5% digitonin와 버퍼 A튜브에서) 여포 막을 파괴하기 위해. 5-10 분 동안 소용돌이가 여포를 더 방해합니다. 분당 ~500회전(RPM)의 가장 낮은 설정에서 30초 동안 큰 여포 조각과 원심분리기 튜브를 긁어냅니다. 새로운 2ml Eppendorf 튜브로 상체를 옮기고, 가시 조직이 작은 입자로 나눌 때까지 버퍼 A. 반복 단계 6.3의 100 μl을 5-7배 사이 추가합니다. 2,000 RPM에서 두 튜브를 10분 동안 회전합니다. 두 튜브 모두에서 상수폐기. 참고: 두 튜브 모두 최종 핵 시각화 슬라이드를 만드는 데 사용됩니다. 수집된 상체관을 가진 관은 주로 추출한 핵을 포함해야 하며, 조직을 가진 원래 튜브는 간호사 세포에 내장된 조직과 핵의 혼합물을 포함할 것이다. 버퍼 A의 200 μl을 추가 – 0.1% 트리톤과 4 °C에서 하룻밤 배양. 원심분리기는 10,000 RPM(10,621 x G)에서 5분 동안 상주분리기를 제거합니다. PBS에 200 μl 4% 파라포름알데히드를 추가합니다. 450 RPM에서 혼합, 30 분 동안 열믹서에서 인큐베이션. 원심분리기는 5,000RPM(2,655 x G)에서 5분 동안 상설을 제거하고 상류부를 제거합니다. 버퍼 A로 0.1% 트리톤으로 5분 동안 세척하고, 써모믹서의 450 RPM에서 혼합합니다. 원심분리기는 5,000RPM(2,655G)에서 5분 동안 상복부를 제거합니다. 튜브에 37°C 표지 프로브에서 미리 따뜻하게 추가합니다. 열믹서에서 95°C에서 450 RPM에서 10분 동안 혼합합니다. 계속 혼합으로 15 분 동안 80 °C에서 계속 데칭하십시오. 써모믹서에서 37°C에서 배양하고 하룻밤 사이에 450 RPM이 혼합됩니다. 원심분리기 5분 5분 5분 5,000 RPM(2,655 x G). 상부체를 제거합니다. 버퍼 A로 5분 동안 0.1% 트리톤으로 세척합니다. 원심분리기 5분 5분 5분 5,000 RPM(2,655 x G). 2번 반복합니다. DAPI로 장간 페이드 방지 한 방울을 적용합니다. 핵/DAPI 용액을 조심스럽게 피펫(거품 을 피하고), 슬라이드에 바르고 커버슬립으로 덮습니다.