JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/51173
, ,
1Department of Entomology,Virginia Tech

Summary

ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).

Abstract

פלואורסצנט בהכלאה במקום (FISH) של בדיקות כרומוזום זרוע שלמות היא טכניקה איתנה למיפוי אזורים גנומיים מעניינים, גילוי סידורים מחדש כרומוזומליים וחקר ארגון כרומוזומים תלת מימדי (3D) בגרעין התא. הופעתו של microdissection לכידת לייזר (LCM) והגברת הגנום כולו (WGA) מאפשר קבלת כמויות גדולות של DNA מתאים בודדים. הרגישות המוגברת של ערכות WGA גרמה לנו לפתח צבעי כרומוזום ולהשתמש בהם לחקר ארגון כרומוזום ואבולוציה באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד ולהגברת מקטעי האוכרומטיות של זרועות כרומוזום פוליטן יחיד מתאי אחות השחלות של יתוש המלריה האפריקאי אנופלס גמביה. הליך זה מספק פלטפורמה יעילה להשגת צבעי כרומוזום, תוך הפחתת הסיכון הכולל להחדרת דנ”א זר לדגימה. השימוש ב- WGA מאפשר מספר סבבים של הגברה מחדש, וכתוצאה מכך כמויות גבוהות של DNA שניתן להשתמש בהם לניסויים מרובים, כולל דגים דו-ממדיים ותלת-ממדיים. הוכחנו כי צבעי הכרומוזום המפותחים יכולים לשמש בהצלחה כדי לבסס את ההתאמה בין חלקים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. בסך הכל, האיחוד של LCM ו- WGA של כרומוזום יחיד מספק כלי יעיל ליצירת כמויות משמעותיות של דנ”א יעד למחקרים ציטוגנטיים וגנומיים עתידיים.

Introduction

ציור כרומוזום היא טכניקה שימושית לחקר האבולוציה של קריוטיפים 1-5 ולהמחיש מומים ציטוגנטיים באמצעות הכלאה של DNA כרומוזומלי שכותרתו פלואורסצנטית 1,6-8. שיטה זו מיושמת גם על לימוד הדינמיקה התלת מימדית של שטחי כרומוזום בפיתוח 9 ופתולוגיה 10. צבעי כרומוזום המסומנים באופן דיפרנציאלי משמשים להדמיה של מיטוטי יחיד 11,12, מיוטי 13,14, או שאינם פוליטנים בין-פאזיים 15,16 ופוליטן 9,11,17 כרומוזומים. פרוטוקול פשוט וחזק להשגת צבעי כרומוזום יהיה שימושי מאוד בהרחבת טכניקה זו לאורגניזמים שאינם מודל, כגון יתושים. מתחם Anopheles gambiae הוא קבוצה של שבעה יתושים בלתי ניתנים להבחנה מורפולוגית המשתנים בהתנהגות ובהסתגלות, כולל היכולת להעביר מלריה.  יתושים אלה משמשים מודל מצוין כדי להבין טוב יותר את האבולוציה של מינים קרובים כי שונים מאוד ביכולת הווקטורית שלהם.  רוב המחקרים הציטוגנטיים יתושים מלריה נעשו באמצעות מפותחים, כרומוזומים פוליטניים מאוד (נבדק ב 18,19). דפוסי הפסים הקריאים של כרומוזומי פוליטן אפשרו לחוקרים להדגים את הקשר בין היפוכים פולימורפיים לבין התאמות אקולוגיות ב Anopheles gambiae 20. כמו כן, תכונות ספציפיות לרקמות של 21 ומינים של כרומוזום פוליטן תלת-ממדי התאפיינו במתחם An. macullipennis. עם זאת, לימוד כרומוזומים מיטוטיים יכול לספק מידע חשוב נוסף. לדוגמה, רמה גבוהה יותר של פולימורפיזם הטרוכרומטין שנצפה בכרומוזומים מיטוטיים כבר בקורלציה עם פעילות הזדווגות מופחתת ופוריות ב An. gambiae 23. קשה לבסס את ההתאמה בין מקטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי רק על ידי השוואת אורכיהם היחסיים. הסיבה לכך היא שהטרוכרומטין מהווה חלק משמעותי בכרומוזומים מיטוטיים, אך אינו מיוצג בכרומוזומים פוליטנים 24. הזמינות של צבעי כרומוזום ליתושים מלריה תאפשר לחוקרים להרחיב באופן משמעותי מחקרים ציטוגנטיים על ידי הכללת מינים נוספים, תוך צמצום משמעותי של העלות והזמן בניתוחים של האבולוציה הקריוטיפית והדינמיקה התלת מימדית של כרומוזומים בקבוצה זו של חרקים חשובים מבחינה אפידמיולוגית.

על מנת להשיג קטעים גדולים של כרומוזומים, microdissection הפך טכניקה אינטגרלית כדי לתפעל ולבודד אזורים ספציפיים של עניין של המשלים כרומוזומלי.  בשילוב עם הגברה גנומית שלמה (WGA), מיקרו-דיסקציה גורמת ליישומים רבי עוצמה במורד הזרם כולל FISH 11,12 ו רצף הגנום של הדור הבא 25-27. בעבר, הטכניקה דרשה שימוש במחטי microdissection מיוחדים שהיו צריכים להיות נשלטים באופן ידני על ידי משתמש מנוסה 28.  ההתקדמות של microdissection לכידת לייזר (LCM) הביא כלי פשוט מתאים יותר עבור בידוד תאים בודדים 29,30 או כרומוזומים בודדים 31-33 עם סיכון פחת של זיהום. גישה זו מאפשרת למשתמש לחקור את ההטרוגניות הגנטית ואת מומים כרומוזומליים המתרחשים בתאים בודדים, במקום נוף קונצנזוס הנובע מאיגום תאים מרובים יחד 34-36. נעשה שימוש בשיטות מרובות כדי להגביר את הדנ”א המופק ממיקרו-דיסקציה.  DOP-PCR, טכניקה שימושית להגברת רצפים שחוזרים על עצמו מאוד, שימשה להגברת כרומוזומים microdissected ממינים כולל חגב 37, צלופחים קוצניים 38, ואת אמנון הנילוס 39.  לאחרונה, ערכת תא יחיד GenomePlex WGA4 מבוסס PCR והגברת תזוזה מרובה מבוסס (MDA) Repli-G תא יחיד ערכה הפכו כלים יקרי ערך לניסויים מעורבים ניתוח גנטי של תאים אנושיים בודדים, כמו גם כרומוזומים40-42, כולל מערכות כרומוזום B בחגבים 37 ו ארבה 43. שתי ערכות אלה כל אחד יש יתרונות וחסרונות, אבל העליונות לכאורה שלהם מעל מערכות הגברה זמינות אחרות הוכח 44.

כמות הדנ”א שניתן להשיג מכרומוזום יחיד או מקטע כרומוזום נמוכה משמעותית מזו של גרעין שלם. לכן מיקרו-דיסקציה, הגברה וניתוח עוקב של כרומוזום יחיד הם הרבה יותר מאתגרים, במיוחד באורגניזמים עם גנומים קטנים כמו בדרוסופילה או אנופלס.  למרות צבעים פותחו כרומוזומים microdissected יחיד של אדם 33 ו צריעה 45, ניסוי FISH מוצלח נדרש מרובים (לפחות 10-15) כרומוזומים מיטוטיים microdissected של זבוב פירות 11. עם זאת, היכולת microdissect ולהגבר כרומוזום יחיד יהיה חשוב עבור (i) הפחתת הסיכוי לזיהום עם חומר כרומוזום שונה, (ii) צמצום מספר ההכנות כרומוזומליות הדרושות microdissection, (iii) הפחתת נוקלאוטידים ופולימורפיזם מבני של המדגם microdissected הן FISH ו רצף במורד הזרם יישומים. כרומוזומי פוליטן המצויים במינים דיפטרניים רבים מציעים הזדמנות ייחודית לרכוש כמות התחלתית גבוהה בהרבה של דנ”א. הם גם מספקים רזולוציה גבוהה יותר ומבנה כרומוזום שלא ניתן להשיג באמצעות כרומוזומים מיטוטיים. רזולוציה נוספת זו יכולה להיות קריטית בהדמיית סידורים מחדש כרומוזומליים, מבנה כרומטין ומקטעים כרומוזומליים להיות microdissected 28,46.

כאן אנו מציגים הליך לבודד ביעילות קטע אוכרומטי מזרוע כרומוזום פוליטן יחיד, להגביר את ה- DNA, ולהשתמש בו ביישומי FISH במורד הזרם יתושים מלריה.  ראשית, אנו מיישמים LCM כדי לבודד ולחלץ זרוע כרומוזום אחת ממגלשות קרום שהוכנו במיוחד. שנית, WGA משמש כדי להגביר את ה-DNA מהחומר microdissected. שלישית, אנו הכלאה DNA מוגברת בניסויים FISH כדי polytene הכנות סקווש 47, metaphase ו שקופיות כרומוזום interphase 48, כמו גם דגימות הר שלמות השחלות 3D. הליך זה נעשה כדי לצייר בהצלחה את רוב האוכרומטין בזרועות כרומוזומליות של An. gambiae.

Protocol

1) הכנת מגלשת כרומוזום פוליטן ללכידת לייזר מיקרו-דיסקציה לנתח נקבות Anopheles חצי gravid ב 25 שעות לאחר האכלת הדם. לתקן שחלות מכחמש נקבות לתוך 500 μl של פתרון קרנוי שונה טרי (100% מתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3:1) בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות. העבר שחלות ל-20 °C (69 °F) לאחסון לטווח ארוך. הכינו את הפתרון של Carnoy (100% אתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3:1) וחומצה פרופיונית 50% ממש לפני הכנת שקופיות כרומוזום. מניחים זוג אחד של שחלות בטיפה אחת של הפתרון של קרנוי על שקופית קרום Zeiss 1.0 PET. בהתאם לגודל, לפצל את השחלות לתוך כ 2-4 חלקים עם מחטים לנתח ומניחים אותם לתוך טיפה של 50% חומצה propionic על שקופיות נקיות תחת מיקרוסקופ ניתוח. יש להפריד זקיקים ולהסיר את הרקמה הנותרת באמצעות מגבת נייר תחת סטריאומיקרוסקופ ניתוק. מוסיפים טיפה חדשה של 50% חומצה פרופיונית לזקיקים ומאפשרים להם לשבת במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר. מניחים כיסוי סיליקון על גבי הטיפה. תן לשקופית לעמוד כדקה. מכסים את השקופית בחומר סופג (נייר סינון משמש לשיטה זו), ותוך שימוש בצד המחק של עיפרון, יש להפעיל כמות נדיבה של לחץ על העטיפה על ידי הקשה עליה שוב ושוב עם המחק. מחממים את השקופית ל 60 °C (60 °F) על מערכת denaturation / הכלאה שקופית במשך 15-20 דקות כדי לסייע בשיטוח כרומוזומי פוליטן. מניחים שקופיות לתוך תא לח ב 4 מעלות צלזיוס לילה כדי לאפשר לחומצה עוד יותר לשטח כרומוזומים. מניחים שקופיות קר 50% אתנול במשך 10 דקות. מוציאים בעדינות את הכיסוי, ומחליפים בקור 50% אתנול למשך 10 דקות נוספות. לייבש שקופיות ב 70%, 90%, 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. מגלשות יבשות באוויר. הכן פתרון של פתרון מאגר GURR על-ידי הוספת טבליית חיץ אחת ל- 1 L של מים מזוקקים. מובלעת אוטומטית. הכינו את פתרון Giemsa על ידי הוספת 1 מ”ל של פתרון כתמי Giemsa ל 50 מ”ל של מאגר GURR. מניחים מגלשות מיובשות באוויר בתמיסת Giemsa למשך 10 דקות ושוטפים שלוש פעמים ב- PBS 1X. אוויר יבש מחליק שוב באקלים סטרילי מבוקר כדי למנוע זיהום. 2) לייזר ללכוד מיקרו-דיסקציה של זרוע כרומוזום פוליטן יחיד סעיף זה מפרט את השימוש בתוכנת PALMRobo, אשר מגיע עם מערכת מיקרודיסציה לייזר PALM MicroBeam. נקה את המיקרוסקופ עם 100% אתנול. לעקר כפפות וצינורות עם אור UV ב- UV-crosslinker. הפעל את מיקרוסקופ המיקרו-דיסקציה של PALM MicroBeam Laser בלייזר והפעל את הלייזר. פתח את חבילת ניתוח הלייזר PALMRobo וקבע את התצורה של הגדרות “צריכת חשמל” ו”מיקוד” לפי הצורך. חפש זרוע כרומוזום פוליטן של עניין. בעזרת הכלי עיפרון, חלוקה לרמות של האזור הנבחר. פתח את “חלון האלמנטים” מתוך שורת התפריטים. בחר את “הרכיב המצויר”, ודא שבחרת באפשרות “גזור”. התקן את צינור כובע דבק לתוך המחזיק ומניחים מעל המגלשה, משאיר רווח קטן <1 מ"מ בגודל, ולהתחיל לחתוך את הלייזר. הנח את “בחירת מעוט” בתוך האתר לחתוך, משאיר רווח בין הקצה הכרומוזום. בחר “LPC” מהאפשרות הנפתחת והתחל בליסטראות. בדוק כדי לוודא שהדגימה הוכנסה למכסה על-ידי לחיצה על סמל “עין”. 3) טיהור הדנ”א מזרוע כרומוזום פוליטנית מיקרו-דיסקית אחת בצע את ההוראות של ערכת מיקרו DNA QIAamp לשחרר ולטהר את ה-DNA שנאסף. שלב 3.1 שונה כדי להתאים לצינור ההפוך. הוסף 15 μl מאגר ATL ו 10 μl proteinase K לצינור הפוך (בתוך הכובע) ואת הדגירה ב 56 °C (69 °F) במשך 3 שעות. הוסף 25 μl מאגר ATL, 50 μl מאגר AL, ו RNA נשא 1 μl; תערובת. להוסיף 50 μl 100% EtOH; לערבב. העבר lysate לעמודה QIAamp; צנטריפוגה, צנטריפוגה. לשטוף על ידי הוספת 500 μl מאגר AW1; צנטריפוגה, צנטריפוגה. מקם עמודה לתוך צינור אוסף חדש, להוסיף 500 μl מאגר AW2; צנטריפוגה, צנטריפוגה. מניחים את העמודה לתוך צינור חדש; צנטריפוגה להסרת נוזלים עודפים. מניחים את העמודה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 μl ומוסיפים 20 μl של מים כדי elute; צנטריפוגה, צנטריפוגה. לאדות DNA מרומם טרי עד נפח סופי של 9 μl באמצעות ואקום. 4) הגברה של דנ”א מזרוע כרומוזום פוליטנית מיקרו-דיסקית אחת שני פרוטוקולים שונים שימשו עבור WGA של זרוע כרומוזום אחת. הגברה של דנ”א והכנת בדיקה באמצעות גנוםפלקס WGA בצע את פרוטוקול ערכת WGA4 תא יחיד GenomePlex כדי לייצר את האצווה הראשונה של DNA מוגבר: הוסף פתרון חלבון K שהוכן טרי לדגימה של 9 μl; לערבב. דגירה DNA ב 50 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה, ולאחר מכן לחמם ל 99 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות. שמור על קרח. הוסף 2 μl 1X מאגר הכנה לספריית תא יחיד ו 1 מיקרומטר של פתרון ייצוב ספריה; מערבבים. מחממים דגימה ל-95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מצננים על קרח וצנטריפוגה. הוסף 1 μl של אנזים הכנת ספרייה; לערבב וצנטריפוגה. דגירה כדלקמן: הוסף 7.5 μl 10X הגברה מאסטר לערבב, 48.5 μl מים. 5.0 μl WGA DNA פולימראז; לערבב וצנטריפוגה. תרמוציקל כדלקמן: לטהר DNA באמצעות DNA גנומי נקי &amp Concentrator קיט. הפרוטוקול הוא כדלקמן: הוסף 5:1 מאגר מחייב DNA:דגימת DNA (במיוחד עבור DNA גנומי של פחות מ 2 kb. אם הדנ”א לדוגמה גדול מ- 2 kb, השתמש ביחס של 2:1) והעבר לעמודת הסיבוב שסופקה. צנטריפוגה, צנטריפוגה. מוסיפים 200 מיקרוגרם DNA לשטוף מאגר צנטריפוגה. חזור על שלב הכביסה. לאחר מכן, מוסיפים 50 μl של מים ו elute ה-DNA לתוך צינור חדש 1.5 מ”ל. הגבר מחדש את הדנ”א לדוגמה באמצעות ערכת ההטמימות GenomePlex WGA3 באופן הבא: הוסף 10 μl DNA לצינור PCR (הערכה ממליצה 10 ng הכולל של DNA) עם 49.5 μl מים, 7.5 μl 10x הגברה מאסטר לערבב, 3.0 μl 10 מ”מ DNTP לערבב, ו 5.0 μl WGA DNA פולימראז. מערבבים וצנטריפוגה. השתמש בפרופיל הבא לתגובה: אחסן דנ”א ב-20°C. סמן דנ”א עבור FISH באמצעות ערכת ההטמנה מחדש של GenomePlex WGA3 כדלקמן: צור תערובת הורים מערכת תב”ע של GenomePlex WGA3 על-ידי הוספת דנ”א של 10 מיקרומטר לצינור PCR עם מים של 49.5 מיקרול, 7.5 μl 10X הגברה מאסטר לערבב, 3.0 μl 1 מ”מ dNTP לערבב (1 מ”ל של dATP, dCTP, dGTP, 0.3 μl 1 mM dTTP – אם באמצעות dUTP שכותרתו), 1 מיקרומטר של 25 nM שכותרתו dUTPP ו-5.0 מיקרוגרם פולימראז דנ”א WGA. השתמש בפרופיל הבא לתגובה: אתנול לזרז את הבדיקה שכותרתו על ידי הוספת 1/10 נפח התגובה הסופי (7.5 μl עבור 75 μl תגובה) של 3 M נתרן אצט pH 5.2 ו 2-3 כמויות של 100% אתנול. דגימת דנ”א צוננת ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. מדגם צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי ליצור גלולה שכותרתו ולהסיר גלולה supernatant ואוויר יבש. צור מאגר הכלאה באופן הבא:0.2 גר’ דקסטרן סולפט1200 μl פורממיד דהוי580 μl H2O120 μl 20X SSC הוסף 40 μl של חיץ הכלאה לכדור מיובש באוויר. הגברה DNA והכנת בדיקה באמצעות REPLI-G תא יחיד WGA ואחריו ניק-תרגום פעל לפי פרוטוקול ערכת WGA של תא יחיד של REPLI-g כדי להפיק את ה- DNA המוגבר: הכן מאגר D2 (3 מיקרומטר של 1 M DTT + 33 μl מאגר DLB). יש לערבב 4 מיקרו-μl של חומר מטוהר עם 3 מיקרול Buffer D2. צינור פליק לערבב. דגירה במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. הוסף 3 μl של פתרון עצירה; לערבב. הוסף 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g מאגר תגובה, ו 2 μl של פולימראז DNA REPLI-g לדגימה. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות. להשבית פולימראז DNA על ידי חימום ל 65 °C (65 °F) במשך 3 דקות. אחסן דנ”א ב-20°C. פעל בהתאם לפרוטוקול התרגום של nick כדי לתייג את ה- DNA המוגבר של REPLI-g: הכן את תערובת התיוג הבאה:1 מיקרוגרם של DNA מוגברמאגר פולימראז DNA 5 μl 10X5 μl 10X dNTP5 מיקרול 1X BSA1 μl 1 מ”מ עם תווית dNTP4 μl 1 U / μl DNase I1 μl 10 U / μl DNA פולימראז אניH2O עד 50 μl דגירה ב 15 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות. הוסף 2 μl של 0.5 M EDTA כדי לעצור את התגובה. בדוק את גודל שבר הדנ”א על ידי ריצה על ג’ל. בצע את השלבים מ 4.1.4.3-4.1.4.6 כדי לזרז ולזלול גלולה. 5) דגים דו-מימדיים על תכשירי דלעת פוליטנית וכרומוזום מיטוטי אנא עיינו בפרוטוקולים מפורטים עבור FISH על הכנות של דלעת פוליטן 47 ומגלשות כרומוזום מיטוטי 48. כאן אנו מספקים פרוטוקולים קצרים. דגים על תכשירי דלעת כרומוזום פוליטן לטבול שקופיות 1X PBS במשך 20 דקות ב RT. לתקן שקופיות ב 4% Paraformaldehyde ב 1X PBS במשך דקה אחת. התייבש שקופיות דרך שטיפות אתנול: 50%, 70%, 90%, 100% במשך 5 דקות כל אחד ב RT. שקופיות יבשות אוויר. מחממים את החללית במאגר הכלאה ב 37 °C (69 °F). הוסף 10-20 μl של בדיקה להחליק. מכסים בכיסויים של 22 X 22 מ”מ. לחץ החוצה כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה. כרומוזומי דנאטורה ובדיקה ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חותם קצוות של כיסוי עם מלט גומי. מעבירים את השקופית לתא לח ומדגדגים ב-39 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף את השקופיות עם 1X SSC ב 39 °C (69 °F) במשך 20 דקות. לשטוף את השקופיות עם 1X SSC ב RT במשך 20 דקות. שטפו שקופיות ב- 1X PBS ולאחר מכן הוסיפו את האפשרות ‘התארך נגד עמעום’ באמצעות DAPI. מכסים עם כיסוי, ומאחסנים בתיבת שקופיות ב- 4 °C (60 °F) למשך שעה לפחות לפני הפריט החזותי. FISH על הכנות דלעת כרומוזום מיטוטי לחלץ כרומוזומים מיטוטיים מדיסקים דמיוניים של זחל 4כוכבים של An. gambiae. הכינו מגלשות כרומוזום המתאימות ל-FISH. הוסף 2-3 μl של בדיקה DNA שכותרתו למאגר הכלאה בצינור ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. החל 10 μl של תערובת בדיקה על השקופית לכסות עם כיסוי 22 X 22 מ”מ. לחץ החוצה כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה. לשיוך וזיהוי נגדיים, יש למרוח את האנטי-עמעום עם DAPI על ההכנה ולשמור בחושך לפחות שעה לפני הפריט החזותי. 6) דגים תלת מימדיים על רקמת שחלות הר שלם הכן את השילוב הבא של מאגר A:60 מ”מ KCl15 מ”מ NaCl0.5 מ”מ זרע0.15 מ”מ זרע2 מ”מ אדטה0.5 מ”מ אגטה15 מ”מ צינורות הכן שקופיות להדמיה גרעינית על-ידי הוספת שכבה של nailpolish בתבנית מרובעת כדי להתאים לגודל של המכבסות. זה יוצר משטח מוגבה כדי למנוע מעוך של גרעינים בעת הנחת על כריכה בעתיד. לנתח שחלות טריות מן השלב של כריסטופר 3 נקבות ולשמור על פתרון של 150-250 μl Buffer A עם 0.5% דיגיטונין. הפעל מחט ניתוח גדולה יותר על זקיקים (בצינור עם חוצץ A עם 0.5% דיגיטונין) כדי להרוס קרום זקיקי. וורטקס במשך 5-10 דקות כדי להפריע עוד יותר זקיקים. לגרד את כל חתיכות זקיק גדול צינור צנטריפוגה במשך 30 שניות בהגדרה הנמוכה ביותר של ~ 500 מהפכות לדקה (סל”ד). להעביר supernatant לצינור חדש 2 מיליליטר Eppendorf, ולהוסיף 100 μl של חוצץ A. חזור על שלב 6.3 בין 5-7 פעמים, עד הרקמה הגלויה מחולק חלקיקים קטנים. לסובב את שני הצינורות במשך 10 דקות ב 2,000 סל”ד. השלך על טבעי בשני הצינורות. הערה: שני הצינורות ישמשו להכנת שקופיות הדמיה גרעינית סופית. הצינור עם supernatant שנאסף צריך להכיל בעיקר גרעינים שחולצו, בעוד הצינור המקורי עם רקמה יכיל תערובת של רקמה וגרעינים מוטבע בתאי האחות. הוסף 200 μl של חוצץ A – 0.1% טריטון דגירה לילה ב 4 °C (69 °F). צנטריפוגה 5 דקות ב 10,000 סל”ד (10,621 x G) ולהסיר supernatant. הוסף 200 μl 4% Paraformaldehyde ב- PBS. דגירה בתרמומקסר במשך 30 דקות, ערבוב ב 450 סל”ד. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל”ד (2,655 x G) ולהסיר supernatant. לשטוף עם חוצץ A עם 0.1% טריטון במשך 5 דקות, ערבוב ב 450 סל”ד תרמומיקסר. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל”ד (2,655 G) ולהסיר supernatant. הוסף מראש מחומם ב 37 מעלות צלזיוס שכותרתו בדיקה לצינור. דנאטורה ב 95 °C (60 °F) בתרמומיקסר, ערבוב ב 450 סל”ד, במשך 10 דקות. המשך denaturation ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם ערבוב מתמשך. דגירה ב 37 °C (69 °F) ב thermomixer, עם 450 סל”ד ערבוב לילה. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל”ד (2,655 x G). הסר על-טבעי. לשטוף עם חוצץ A עם 0.1% טריטון במשך 5 דקות. צנטריפוגה 5 דקות ב 5,000 סל”ד (2,655 x G). חזור על הפעולה פעמיים. החל טיפה של התארכות נגד עמעום באמצעות DAPI. צנרת החוצה גרעיני / DAPI פתרון בזהירות (הימנעות בועות), להחיל על שקופית, לכסות עם coverlip.

Representative Results

איור 1 מתאר את הזרימה הכוללת של הפרוטוקול המתואר במאמר זה.  המשתמש מתחיל בתחילה על ידי דגימות DNA כרומוזום microdissecting משקופיות קרום.  חומר מיקרו-מוזה מופק ומטוהר. לאחר מכן הדנ”א המטוהר מוגבר, מוגבר מחדש, מסומן מחדש ולאחר מכן משמש את FISH לתיוג ממרחי כרומוזום. ניתן לחלק את פרוטוקול LCM לשלושה שלבים כוללים: 1) מציאת כרומוזומים מעניינים והכנת האזור לחיתוך(איור 2A),2) חיתוך וחיתוך אזור הכרומוזום המעניין באמצעות לייזר(איור 2B) בדיקהכדי לקבוע אם הדגימה אכן מוחלקת לכובעדבק (איור 2C). התהליך של LCM בשימוש על כרומוזומי פוליטן זן An. gambiae סואה מוצג וידאו 1. הסרטון מפרט את התהליך כולו מהפעלת התוכנית, כולל פונקציות תוכנה חשובות וטיפים. ערכות WGA של תא יחיד GenomePlex ו- REPLI-g המשמשות בפרוטוקול זה שונות מאוד בגודל המוצר וכתוצאה מכך בתפוקה הכוללת.  איור 3 מראה את התוצאות של אלקטרופורזה ג’ל רץ עבור GenomePlex ו REPLI-g ערכות, כמו גם כימות של הדגימות על ידי Nanodrop. חומר Microdissected שימש ליצירת בדיקות FISH כי היעד אזורים אוכרומטיים של כרומוזום.  איור 4 מדגים דגים של חמש גשושיות שנוצרו מחומר מיקרו-סודי על כרומוזומי פוליטן של א. גמביה.  ארבע זרועות אוטוזומליות סומנו עם שלושה פלואורופורים באמצעות ערכת WGA3: כרומוזום 3R מסומן בירוק (פלואורסצנט), כרומוזום 3L הוא בתערובת של אדום (Cy-3) וצהוב (Cy-5), כרומוזום 2R הוא בצהוב (Cy-5), ואת כרומוזום 2L הוא באדום (Cy-3). כרומוזום X תויג בכתום (Cy-3) באמצעות ניק-תרגום של חומר REPLI-g בניסוי נפרד. כדי לבסס את ההתכתבות בין חלקים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי, צבעי כרומוזום הוכלאו לכרומוזומים בין-פאזיים, פרופאז, פרומטאפאז ומטאפאאז של א. גמביה (איור 5).  כדי לדמיין את הארגון 3D של זרוע אחת כרומוזום פוליטן בגרעין התא, דגים הר שלם בוצע על An. gambiae Sua זן תאים אחות השחלות (וידאו 2).  שטחי זרוע כרומוזום מובחנים נראים בבירור בגרעין עם כרומוזומי אינטרפאז(איור 5D)ופוליטן (וידאו 2). איור 1. ייצוג סכמטי של ההליכים הניסיוניים לקראת הכנת צבעי כרומוזום. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. איור 2. השלבים העיקריים במיקרו-דיסקציה כרומוזום. A) חיתוך בסיוע לייזר של האזור הכרומוזומלי של עניין דרך הממברנה. ב) הממברנה עם חור לאחר הבליסטראות מבוצעת. ג) הנוף של החתיכה המפוספסת של הממברנה עם קטע כרומוזומלי בתוכה מחובר לכובע הדבק. החץ מציין את ההטרוכרומטין של כרומוזום X שנשאר בשקופית. כוכבית מראה חתיכה של כרומוזום אחר שנשאר על המגלשה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. איור 3. תמונות ג’ל אגרוז מראה DNA אחרי WGA. A) משקל מולקולרי נמוך (200-500 bp) DNA מזרוע 3R לאחר שימוש בערכות WGA4 ו- WGA3 GenomePlex. B) משקל מולקולרי גבוה (10-20 kb) DNA מזרוע 2L לאחר הגברה REPLI-g. סולם 100 bp מוצג בנתיבים השמאליים. הטבלאות מתחת לתמונות ג’ל מראות ריכוזי דנ”א הנמדדים על ידי Nanodrop. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. איור 4. ציור של כרומוזומי פוליטן מתאי אחות השחלות של א. גמביה באמצעות ארבע בדיקות שנוצרו מחומר מיקרו-דיסקטי. כרומוזום X מסומן בכתום (Cy-3) על ידי תרגום ניק של חומר REPLI-g. זרוע 2R מסומנת בצהוב (Cy-5); זרוע 2L היא באדום (Cy-3); זרוע 3R מסומנת בירוק (פלואורסצנטין); זרוע 3L מסומנת בתערובת של אדום (Cy-3) וצהוב (Cy-5). אוטומטיים מסומנים בערכת ההגברה WGA3. כרומטין מוכתם בכחול (DAPI). שמות כרומוזומים ממוקמים ליד אזורים טלומריים. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. איור 5. ציור של כרומוזומים בין-פאזיים (A), פרופאז (B), פרומטאפאז (C) וכרומוזומים של מטפאאז (D) מדיסקים דמיוניים זחלים של זן א. גמביה מופטי באמצעות שלוש בדיקות שנוצרו מחומר מיקרו-סודי המסומן על ידי WGA3. זרוע 2R מסומנת בירוק (פלואורסצנטין); זרוע 2L היא ללא תווית; זרוע 3R היא בוורוד, תערובת של אדום (Cy-3) וכתום (Cy-5); זרוע 3L מסומנת בכתום (Cy-5). לכרומוזום X יש תווית אדומה המתאימה לבדיקת 18S rDNA. כרומטין מוכתם בכחול (DAPI). אזורים מוכתמים בבהירות של כרומוזומים תואמים את ההטרוכרומטין. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. וידאו 1. התהליך של LCM של כרומוזומי פוליטן An. gambiae. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון 1. וידאו 2. כל הר 3D FISH שבוצע על An. גמביה תאים אחות השחלות. הגשושית מסומנת ב-Cy-3 (מתוארת בכחול) והתבצעה מזרוע כרומוזום 2R מיקרו-דיסקית.  כרומטין היה מוכתם ב- DAPI ומתואר על ידי ציאן פסאודו-צביעה (כחול בהיר). לחץ כאן כדי לצפות בסרטון 2.

Discussion

ישנם שלבים רבים קריטיים כדי להגביר בהצלחה את ה-DNA מדגימות כרומוזום פוליטן microdissected. הפרוטוקול משתמש בשימוש ב- LCM, שיטה הן מגבירה את היעילות הכוללת ומפחיתה את החשיפה לדנ”א זר על ידי הסרת האינטראקציה של כלים פיזיים עם הדגימה. עם זאת, הגברה של דנ”א זר היא עדיין המלכודת הפוטנציאלית הגדולה ביותר של ניסוי זה. לכן, במהלך כל התהליך, זה חיוני כדי לשמור על הדגימות מוגנות מפני זיהום. לאורך כל הכנת שקופית ושלבי microdissection, זה חיוני כדי לשטוף אתנול מחטי דיסקציה, שקופיות, לכסות מעידות, כמו גם את סביבת העבודה.  מומלץ גם UV לטפל בכל הציוד הישים (מחטים, שקופיות, coverslips) לפני השימוש.

הממברנה על שקופיות הניתוח מקשה מאוד על התפשטות הכרומוזומים.  חשוב להשתמש יותר של השחלה (חצי לזוג מלא של שחלות) בעת ביצוע שקופיות אלה, כדי לספק סיכוי גדול יותר למצוא גרעין התפשטות היטב.  מומלץ גם להשתמש ברקמה טרייה בעת ביצוע שקופיות, כמו שיעורי הגברה נראה לרדת כמו רקמות גיל 49 והתפשטות כרומוזום הופך להיות מאתגר יותר.  הכנת שקופיות עבור microdissection הוא הצעד זמן רב ביותר בפרוטוקול זה.  כרומוזומים חייבים להתפשט היטב כדי למנוע רכישה בשוגג של חומר לא רצוי.  כתמי Giemsa מאפשרים למשתמש לבדוק את איכות ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה לפני השימוש במערכת המיקרו-דיסקציה.

השילוב של מיקרו-דיסקציה והגברה מספק את ההזדמנות לחלץ ולנתח שברים כרומוזומליים בגודלם מאזורים קטנים בעלי עניין לרוב הזרועות.  פרוטוקול זה מאפשר למשתמש להשיג דנ”א מאזורים שונים מבחינה מורפולוגית כגון היפוכים, רצועות אוכרומטיות ספציפיות וסרטים בין-דוריים, הטרוכרומטין טלומרי, סנטימטרי ובין-כוכבי. המשתמש יכול ליישם את בדיקות הציור שנוצרו כדי לבחון כרומוזומים חריגים, לחקור הומולוגיה בין מינים בלוקוסים מסוימים, או לאפיין ארגון מרחבי של כרומוזומים בגרעין תלת מימד שלם. לפיתוח צבעי כרומוזום, בחרנו מקטעים אוכרומטיים כדי למנוע הכלאה של דנ”א חוזר עם אזורים כרומוזומליים מרובים. כתוצאה מכך, השגנו ציור ספציפי לזרוע מבלי להשתמש במתחרה, כמו דנ”א גנומי כולל או שבר DNA C0t-1.

בחרנו להשתמש בערכות GenomePlex WGA ו- REPLI-G בהתבסס על ביקורות שהשוו את יעילות ושיעור הנשירה של ערכות הגברה מרובות 40,44.  שתי הערכות ביצעו את הטוב ביותר מבין השיטות הזמינות בשני שיעור הנושרים (GenomePlex היה שיעור של 12.5% לעומת 37.5% של REPLI-g%) ואחוז הסמנים המוגברים (ל-GenomePlex היה שיעור הגברה של 45.24% לעומת 30.0% של REPLI-g). 40. ערכת GenomePlex סיפקה גם כמות גבוהה יותר של DNA, ובכך הפכה אותה למועמדת טובה יותר לטכניקות מרובות במורד הזרם.  ערכת הגברה מחדש למערכת GenomePlex זמינה גם היא, ומאפשרת הגברה נוספת של הדנ”א. עם זאת, חשוב לציין כי הגברה אינה מושלמת.  האפשרות נשארת כי הגברה מוצלחת יכולה להציג שגיאות או יש הטיה כלפי loci ספציפי ב- DNA היעד. חשוב לקחת בחשבון את גודל הקטע הסופי של שיטות הגברה הגנום הזמינות.  פיצול GenomePlex גורם לספריה עם שברים הנעים בין 200-500 bp, בעוד שערכת REPLI-g מייצרת שברים בגודל של כ- 10-20 kb. היישום המיועד במורד הזרם של פרוטוקול זה הוא FISH, ובכך להפוך את ערכת GenomePlex אפשרות אפשרית יותר, כפי שהוא סיפק את גודל הקטע הרצוי ואת היכולת לתייג שברי DNA ישירות דרך WGA. מולקולות דנ”א ארוכות המיוצרות על ידי הגברה REPLI-g חייב להיות מקוטע בתגובת תיוג ניק-תרגום במורד הזרם.

פרוטוקול זה הותאם כדי להגביר בהצלחה את הדנ”א מזרוע כרומוזום פוליטן אחת.  פרוטוקולים אחרים דורשים איגום של שברי כרומוזום רבים (בדרך כלל 10-30) כדי להגביר בהצלחה את המדגם 7,11,28,40.  למרות איגום של כרומוזומים מרובים אפשרי בשיטה שלנו, הסבירות המוגברת של זיהום מדגם מדגיש את החשיבות של תחילת הניסוי עם כמה שפחות כרומוזומים. אם כרומוזומי פוליטן אינם זמינים, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לשימוש בכרומוזומים מיטוטיים. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בריכה 10-15 כרומוזומים מיטוטיים לפני הגברה עבור דגים מוצלחים 11. הטיית הגברה נמוכה יותר עם כמויות גבוהות של DNA תבנית התחלתית 50. כרומוזומי פוליטן מספקים כ-512 עותקים של רצף דנ”א יחיד ו-1024 עותקים של שני רצפי דנ”א הומולוגיים.  לכן, איגום כרומוזומים מיטוטיים יעזור להגדיל את האיכות הכוללת של מוצר DNA לאחר הגברה.

הליך זה יש שימושים פוטנציאליים רבים במחקרים ציטוגנטיים וגנומיים. כאן, השתמשנו בצבעי כרומוזום כדי לבסס את ההתאמה בין קטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. ניתן להחיל את אותן בדיקות ציור על אפיון ציטוגנטי של קווי התא של א. גמביה. סידורים גנומיים נרחבים ושינויים במספרי הכרומוזום הם מאפיינים נפוצים של קווי תאים 51,52. סידורים מחדש של כלנית, פוליפלוידיה וכרומוזומליים כגון טרנסלוקציות, היפוכים, מחיקות וכרומוזומי טבעת זוהו בשורות שונות של תאי יתושים 53,54. תצפיות ציטוגנטיות קלאסיות 55 ומיפוי פיזי 56 הדגימו את התרחשותן של טרנסלוקציות כרומוזומליות בזרוע כולה באבולוציה של יתושים מלריה. לכן, חומר microdissected יכול לשמש בשילוב עם ניסויים FISH להשוות הומולוגיה של אזורים כרומוזומליים בין מינים. ביצענו בהצלחה דגים תלת מימדיים עם הגשושית 2R-painting על כרומוזומי פוליטן בתאי אחות בשחלות הר שלם. שיטה זו תקל על המעקב אחר מסלולי כרומוזום וללמוד את הארכיטקטורה הגרעינית ב Anopheles. טכניקות כמו genotyping DNA 57,58, הדור הבא של רצף הגנום 26,27, פיתוח מפת פיזית וחיבור, ודור של בדיקות לציור כרומוזום 33,59 כל יכול להפיק תועלת זרוע באזור ספציפי microdissection. על ידי שילוב טכנולוגיית LCM וקידום WGA חד-תאי, אנו מדגימים שיטה יעילה ומעשית לייצור כמויות סבירות של דנ”א מזרוע כרומוזום פוליטנית אחת.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המענק של המכונים הלאומיים לבריאות 1R21AI094289 לאיגור נ’ שרקוב

Materials

Acetic acid Fisher Scientific A491-212
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Propionic acid  Sigma-Aldrich 402907
Membrane slides 1.0 PET Zeiss 415190-9051-000
Buffer tablets “GURR” Life Technologies 10582-013
KaryoMAX Giemsa Stain Life Technologies 10092-013
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System Abbott Molecular 30-144110
Vacufuge vacuum concentrator Eppendorf 22820001
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Thermo Scientific NanoDrop Fisher Scientific ND-2000
REPLI-g Single Cell Kit Qiagen 150343
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) Sigma-Aldrich WGA4-10RXN
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) Sigma-Aldrich WGA3-50RXN
MZ6 Leica stereomicroscope Leica VA-OM-E194-354 A different stereomicroscope can be used
Olympus CX41 Phase Microscope Olympus CX41RF-5 A different phase microscope can be used
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope Zeiss
Thermomixer Eppendorf 22670000
10x PBS Invitrogen  P5493
50x Denhardt’s solution Sigma-Aldrich D2532
99% Formamide Fisher Scientific BP227500
Dextran sulfate sodium salt Sigma D8906
20x SSC buffer Invitrogen  AM9765
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen  P-36931
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Fermentas R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP GE Healthcare PA53022, PA55022
BSA Sigma-Aldrich A3294
DNA polymerase I Fermentas EP0041
DNase I  Fermentas EN0521
Spermine Sigma-Aldrich S3256-1G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-1G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP3581
EGTA Sigma-Aldrich E0396-25G
PIPES Sigma-Aldrich P6757-25G
EDTA Fisher Scientific S311-500
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Triton-X100 Fisher Scientific BP151-100
AdhesiveCap 500 clear Zeiss 415190-9211-000
QIAamp DNA Micro Kit (50) Qiagen 56304
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4010
37% Paraformaldehyde Fisher Scientific F79-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Ried, T., Schrock, E., Ning, Y., Wienberg, J. Chromosome painting: a useful art. Human molecular genetics 7. , 1619-1626 (1998).
  2. Yang, F., et al. Reciprocal chromosome painting illuminates the history of genome evolution of the domestic cat, dog and human. Chromosome Res. 8, 393-404 (2000).
  3. Badenhorst, D., Dobigny, G., Robinson, T. J. Karyotypic evolution of hapalomys inferred from chromosome painting: a detailed characterization contributing new insights into the ancestral murinae karyotype. Cytogenet Genome Res 136. , 83-88 (2012).
  4. Trifonov, V. A., et al. Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843-855 (2011).
  5. Nie, W., et al. Chromosomal rearrangements and karyotype evolution in carnivores revealed by chromosome painting. Heredity (Edinb. , 108-1017 (2012).
  6. Guan, X. Y., et al. Detection of chromosome 6 abnormalities in melanoma cell lines by chromosome arm painting probes). Cancer Genet Cytogenet. 107, 89-92 (1998).
  7. Guan, X. Y., et al. Characterization of a complex chromosome rearrangement involving 6q in a melanoma cell line by chromosome microdissection. Cancer genetics and cytogenetics 134. , 65-70 (2002).
  8. Breen, M., et al. Detection of equine X chromosome abnormalities in equids using a horse X whole chromosome paint probe (WCPP). Vet J. 153, 235-238 (1997).
  9. Kokhanenko, A. A., Anan’ina, T. V., Stegniy, V. N. The changes in chromosome 6 spatial organization during chromatin polytenization in the Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) nurse cells. Protoplasma 250. , 141-149 (2013).
  10. Timme, S., et al. Nuclear position and shape deformation of chromosome 8 territories in pancreatic ductal adenocarcinoma. Anal Cell Pathol (Amst. 34, 21-33 (2011).
  11. Drosopoulou, E., et al. Sex chromosomes and associated rDNA form a heterochromatic network in the polytene nuclei of Bactrocera oleae (Diptera: Tephritidae). Genetica. 140, 169-180 (2012).
  12. Pazian, M. F., Shimabukuro-Dias, C. K., Pansonato-Alves, J. C., Oliveira, C., Foresti, F. Chromosome painting of Z and W sex chromosomes in Characidium (Characiformes). Crenuchidae). Genetica. 141, 1-9 (2013).
  13. Howe, E. S., Murphy, S. P., Bass, H. W. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol 990. , 53-66 (2013).
  14. Lysak, M. A., Mandakova, T. Analysis of plant meiotic chromosomes by chromosome painting. Methods Mol Biol 990. , 13-24 (2013).
  15. Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel OctoChrome FISH assay. J Vis Exp. 10, (2012).
  16. Idziak, D., et al. Painting the chromosomes of Brachypodium: current status and future prospects. Chromosoma. 120, 469-479 (2011).
  17. Fuchs, J., Kuhfittig, S., Reuter, G., Schubert, I. Chromosome painting in Drosophila. Chromosome Res. 6, 335-336 (1998).
  18. Zhimulev, I. F. . Morphology and structure of polytene chromosomes. 34, 1-490 (1996).
  19. Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. in Chromosome Mapping Research Developments eds. J.F. Verrity & L.E. Abbington) (Nova Science. , (2008).
  20. Coluzzi, M., Sabatini, A., Torre, d. e. l. l. a., Di Deco, A., A, M., Petrarca, V. A polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex). Science. 298, 1415-1418 (2002).
  21. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malaria mosquitoes. Genetika. 23, 821-827 (1987).
  22. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malarial mosquitoes. II. Species specificity in the pattern of chromosome relations with the nuclear envelope of nutrient ovarian cells. Genetika. 23, 1194-1199 (1987).
  23. Bonaccorsi, S., Santini, G., Gatti, M., Pimpinelli, S., Colluzzi, M. Intraspecific polymorphism of sex chromosome heterochromatin in two species of the Anopheles gambiae complex. Chromosoma. 76, 57-64 (1980).
  24. Zhimulev, I. F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet. 37, 1-566 (1998).
  25. Seifertova, E., et al. Efficient high-throughput sequencing of a laser microdissected chromosome arm. BMC Genomics. 14, 1471-2164 (2013).
  26. Weise, A., et al. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions. European journal of human genetics. EJHG. 18, 457-462 (2010).
  27. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 19. , 395-406 (2012).
  28. Moshkin, Y. M., et al. Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogastermutant Suppressor of Underreplication. Chromosoma. 111, 114-125 (2002).
  29. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Laser Mahalingam, M. capture microdissection: methods and applications. Methods Mol Biol 755. , 1-15 (2011).
  30. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. 10, (2010).
  31. Kubickova, S., Cernohorska, H., Musilova, P., Rubes, J. The use of laser microdissection for the preparation of chromosome-specific painting probes in farm animals. Chromosome Res. 10, 571-577 (2002).
  32. Fukova, I., et al. Probing the W chromosome of the codling moth, Cydia pomonella, with sequences from microdissected sex chromatin. Chromosoma. 116, 135-145 (2007).
  33. Thalhammer, S., Langer, S., Speicher, M. R., Heckl, W. M., Geigl, J. B. Generation of chromosome painting probes from single chromosomes by laser microdissection and linker-adaptor PCR. Chromosome Res. 12, 337-343 (2004).
  34. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a chip 7. , 423-440 (2007).
  35. Hutchison, C. A., 3rd, J. C., Venter, Single-cell genomics. Nature biotechnology. 24, 657-658 (2006).
  36. Lasken, R. S., Egholm, M. Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in biotechnology 21. , 531-535 (1016).
  37. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Cytogenet Genome Res. 125, 286-291 (2009).
  38. Liu, J. D., et al. Sex chromosomes in the spiny eel (Mastacembelus aculeatus) revealed by mitotic and meiotic analysis. Cytogenet Genome Res. 98, 291-297 (2002).
  39. Harvey, S. C., et al. Molecular-cytogenetic analysis reveals sequence differences between the sex chromosomes of Oreochromis niloticus: evidence for an early stage of sex-chromosome differentiation. Cytogenet Genome Res. 97, 76-80 (2002).
  40. Hockner, M., Erdel, M., Spreiz, A., Utermann, G., Kotzot, D. Whole genome amplification from microdissected chromosomes. Cytogenet Genome Res. 125, 98-102 (2009).
  41. Kitada, K., Taima, A., Ogasawara, K., Metsugi, S., Aikawa, S. Chromosome-specific segmentation revealed by structural analysis of individually isolated chromosomes. Genes Chromosomes Cancer. 50, 217-227 (2011).
  42. Ma, L., et al. Direct determination of molecular haplotypes by chromosome microdissection. Nature methods. 7, 299-301 (2010).
  43. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in Locusta migratoria. Chromosome Res. 17, 11-18 (2009).
  44. Treff, N. R., Su, J., Tao, X., Northrop, L. E., Scott, R. T. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses. Molecular human reproduction 17. , 335-343 (2011).
  45. Rutten, K. B., et al. Chromosomal anchoring of linkage groups and identification of wing size QTL using markers and FISH probes derived from microdissected chromosomes. in Nasonia(Pteromalidae : Hymenoptera). Cytogenetic and Genome Research 105. , 126-133 (2004).
  46. Post, R. J., Kruger, A., Somiari, S. B. Laser-assisted microdissection of polytene chromosomes from Diptera for the development of molecular markers. Molecular Ecology Notes. 6, 634-637 (2006).
  47. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-throughput physical mapping of chromosomes using automated in situ hybridization. Journal of visualized experiments : JoVE. 10, (2012).
  48. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes. J Vis Exp. 10, (2012).
  49. Frumkin, D., et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. BMC biotechnology. 8, 10-1186 (2008).
  50. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and environmental microbiology 71. , 3342-3347 (2005).
  51. Cassio, D. Long term culture of MDCK strains alters chromosome content. BMC Res Notes. 6, 162-1610 (2013).
  52. Landry, J. J., et al. The Genomic and Transcriptomic Landscape of a HeLa Cell Line. G3. , (1534).
  53. Steiniger, G. E., Mukherjee, A. B. Insect chromosome banding: technique for G- and Q-banding pattern in the mosquito Aedes albopictus. Can J Genet Cytol. 17, 241-244 (1975).
  54. Brown, S. E., et al. Toward a physical map of Aedes aegypti. Insect Mol Biol. 4, 161-167 (1995).
  55. Green, C., Hunt, R. Interpretation of variation in ovarian polytene chromosomes of Anopheles funestus Giles. A. parensis Gillies, and A. aruni? Genetica. 51, 187-195 (1980).
  56. Sharakhova, M. V., Xia, A., Leman, S. C., Sharakhov, I. V. Arm-specific dynamics of chromosome evolution in malaria mosquitoes. BMC evolutionary biology. 11, 10-1186 (2011).
  57. Gu, L. H., et al. DNA genotyping of oral epithelial cells by laser capture microdissection]. Fa yi xue za zhi 22. , 196-197 (2006).
  58. Rook, M. S., Delach, S. M., Deyneko, G., Worlock, A., Wolfe, J. L. Whole genome amplification of DNA from laser capture-microdissected tissue for high-throughput single nucleotide polymorphism and short tandem repeat genotyping. The American journal of pathology 164. , 23-33 (2004).
  59. Houen, A., Field, B. L., Saunders, V. A. Microdissection and chromosome painting of plant B chromosomes. Methods in cell science : an official journal of the Society for In. Vitro Biology. 23, 115-124 (2001).

Tags

Chromosome PaintingFISHLaser Capture MicrodissectionWhole Genome AmplificationAnopheles GambiaeMalaria MosquitoPolytene ChromosomeChromosome OrganizationCytogenetics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
George, P., Sharma, A., Sharakhov, I. V. 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (83), e51173, doi:10.3791/51173 (2014).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image