Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma
Summary
Klinik açıdan uygun bir metastatik meme kanseri duktal meme sistemi sonuçları içine adenovirüs-Cre ile gizli mutasyonlar aktivasyonu. YFP bir promoter dahil edilmesi uzak metastatik tümör hücrelerinin izleme sağlar. Bu model, latent metastazı, anti-tümör bağışıklık ve meme kanseri tedavisi için yeni immünoterapiler tasarımı için incelemek için yararlı olan.
Abstract
Meme kanseri sonunda uzak dokularda ve anti-tümör bağışıklık çöküşüne üstel tümör büyümesi ve metastaz ile sonuçlanan, gelişmekte olan tümör ve immün sistemi arasında karmaşık bir hücre etkileşimleri içeren bir heterojen bir hastalıktır. Birçok yararlı hayvan modelleri meme kanseri çalışma var, ama hiçbiri tamamen insanlarda meydana hastalığın ilerlemesini recapitulate. Latent metastaz oluşumuna neden olabilir ve azalmış sağkalım hücresel etkileşimler daha iyi anlamak amacıyla, biz, bağışıklık-kompetan farelerde cinsel olgunluk sonra gelişir ve tahrik edilir YFP ifade duktal karsinom, indüklenebilir bir fare modeli oluşturduk adres tutarlı, endokrin bağımsız onkojen ifadesi ile. YFP, p53 aktivasyonu ablasyon ve K-ras bir onkojenik biçimi ifadesi cinsel olarak olgun, bakire dişi farelerin meme kanalı içine Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs teslimatı ile elde edilmiştir. Tümörler6 hafta onkojenik olayların başlamasından sonra görünmeye başlar. Tümörler belirgin hale sonra onlar katlanarak büyümeye başlamadan önce, bunlar yaklaşık iki hafta boyunca yavaş yavaş ilerleme. 7-8 hafta sonrası adenovirüs enjeksiyon sonrası, damar uzak aksiller lenf düğümlerine YFP + tümör hücrelerinin nihai lenfovasküler işgali ile, uzak lenf bezlerine tümör kitlesini bağlayan görülmektedir. Infiltratif lökosit popülasyonları αβ ve γδ T hücreleri, makrofajlar ve MDSCs varlığı da dahil olmak üzere insan göğüs karsinom, bulunanlara benzemektedir. Bu eşsiz modeli invasif göğüs kanserinin tedavisi için yeni bir immünoterapötik müdahaleler tasarımı için kullanışlı olmanın yanı sıra latent metastaz ve uyuşukluk dahil hücresel ve imünolojik mekanizmalar çalışma kolaylaştıracaktır.
Introduction
Meme kanseri dünyada 1,2 ve kansere bağlı ölümlerin 2 ikinci önde gelen nedeni genelinde kadınlarda en sık görülen kanseridir. Kompleks genetik 3,4, 5 histolojik ve klinik fenotipleri 6 meme kanseri, çeşitli alt tipleri karakterize etmek için kullanılır ve genellikle hayatta kalma tahmin etmek için bir araç olarak kullanılır. Meme kanseri olan kadınların büyük bir kohort analizi ölen hastaların (yaklaşık% 80) en çok primer tümörün 7 10 yıl sonrası çıkarıldıktan içinde nüks ettiğini belirtti. Invaziv meme karsinomlarının bir çoğunluğu için, Lenfovasküler güçlü bir kötü sonuç ve hastalığın 8 daha agresif klinik seyri korelasyon olduğu gösterilmiştir.
Çünkü meme kanserinin genetik ve fenotipik karmaşıklık, hastalığın bütün seyrini özetlediği bir hayvan modeli yoktur. İnsan göğüs tümörü hücre çizgileri sık olmuşturksenograft ya da bağışıklık eksikliği olan farelerde invaziv ve metastatik meme kanseri ortotopik 9 model olarak kullanılmıştır. Her ne kadar bu detaylı bir çapraz tür aşı olduğu için, bu modeller, tüm tümör mikro etkilerini bozar, bağışıklık baskısı yokluğunda meydana gelir ve. Bu tür kemirgen meme tümörü virüsü (MMTV) ve kesilmiş süt suyu asidik protein (WAP) gibi meme özel promotörler ile tahrik indüklenebilir genetik mutasyonlar göğüs kanserinin genetik yapısı hakkında bilgi muazzam bir katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu promotörlerin dokuya özgü sentezleme tipik insan göğüs kanserinde aşırı ifade onkogenlerin ekspresyonunu ayna yok kaynaklı genetik mutasyon değişken ekspresyonu ile sonuçlanan, endokrin sistem 10-16 için kendi yanıt tarafından tehlikeye girer. Onkogenlerin MMTV tahrik ifade endokrin kontrol üstesinden gelmek için, Moody ve ark. Memede Neu aşırı ifade eden bir koşullu, doksisiklin uyarılabilir modeli oluşturdukepitel 17. Bu model regresyon ve nüks çalışma Tümör oluşumundan sonra Neu deinducing için yararlıdır, ancak tutarlı, uzun vadeli onkogen ifade için sürekli doksisiklin uygulanmasını gerektirir. Mevcut çok sayıda alakalı göğüs tümör modellerinin ayrıntılı bir tartışması Vargo-Gogola et al. 10 ile inceleme bulunabilir
Amacımız, tam bir C57BL / 6 arka plan üzerinde izlenebilir, meme kanseri, bir fare modeli geliştirmek için olduğu, mutasyon olayları, modeller bağışıklık basınç mevcudiyetinde bir olgunlaşmamış tümör oluşumu kalıcı indüksiyonundan sonra. Bu TP53 of floxed alelleri ve K-ras bir onkojenik biçimi ve YFP içeren transjenik farelerin meme kanallarına Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs getirmiştir. Cre ifade TP53, bir çok meme kanserlerinde 18'de sık mutasyona uğramış gen ablates ve spesifik olarak YFP ifade ek olarak K-ras bir onkojenik allel indüklermeme duktal epitelyum içinde. K-ras mutasyonu, meme kanseri hastalarının 19,20 sadece% 6.5 'de meydana gelen, meme kanseri sık olmasına rağmen, insan meme tümörleri içinde Ras sinyal yolağının konstitütif aktivasyonu Her2/neu ve EGFR sonucunda yukarı kinazların aşın 21-23. Birçok meme tümör hücre hatlarında Ras sinyal yolunun aktivasyonu, aynı zamanda 24,25 bildirilmiştir. Tümör oluşumu başlangıcı ve cinsel olarak olgun, bakire dişi farelere Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs intraduktal enjeksiyon tekniği anlatacağız. Meme kanseri Bu model, 7-8 hafta koltuk altı lenf düğümü Lenfovasküler invazyon ve metastaz ile yavaş tümör progresyonunun yaklaşık 8 hafta sonra katlanarak büyümeye açık lezyon gelişir. Bu fareler tam bir C57BL / 6 arka plan üzerinde ve YFP ifade tümör hücrelerinin uzak lenf düğümlerinde izlenebilir, çünkü bu model ce incelemek için ilgili bir araç sağlarllular ve immünolojik gizli metastaz mekanizmaları ve metastatik duktal meme kanserinin tedavisi için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu prosedürün başarısı eğitimsiz deneyciler için zor olacak, intraduktal enjeksiyonlar sırasında tekniğine uygun menteşe. Laboratuvarımızda deneyimli araştırmacılar genellikle meme tümörü kitleler onlar adenoviral enjeksiyonları yönetmek kez% 79 edinin. Enjeksiyon ile ilgili sorunlar önemli ölçüde gecikmiş, değişken ya da yoktur tümör gelişimine neden olabilir. İğne çok derin ya da uygunsuz bir açıyla takılırsa, duktal kanal kaçırmış olabilir. Bu, meme dokusu yoluyla ve ventral vücut boşluğunun seröz zarlar içine nüfuz etmesini önlemek için, hafifçe iğnenin (en fazla 2 mm) arasında konik geçen meme girmek önemlidir. Aynı zamanda, virüs çökeltilerin daha büyük 3 ml iğne ya da enjeksiyon çok sığ yerleştirme meme bezi ve istenmeden tümör indüksiyonu dışında viral hazırlık dökülmesine neden olabilir. Bu sorunları aşmak için bir yolu biraz DEEPE meme içine iğne eklemek içinr 3 mm, ve yavaş yavaş eğimin ucundan 2 mm kadar geri kanalın dışına şırınga çekmek daha. Bu, meme dokusu yerine farelerin peritonal boşluğuna (Şekil 1A) çevreleyen kas hedeflenmesini sağlamak olacaktır. Virüs kanal içine atıldığı zaman, viral çökeltilerin ve herhangi bir dökülme kaybı vardır, böylece bu da şırınga kenarları boyunca meme uzatılır.
Enjeksiyon görselleştirilmesi zordur ve bu aşama için uygulama önerilir. Biz tümör gelişiminin daha yüksek penetrans sonuçlanan, uygulamada aşağıdaki başarılı enjeksiyonları bir artış gözlemledik. Bu teknik, bakire kadın laktasyonda olmayan kullanır, çünkü altta yatan kanal kanal ortaya çıkarmak için meme kaplayan keratin fişi çıkarmak için çok önemlidir. Biz, kanal içinde tripan mavisi veya diğer bir steril enjekte izlenebilir boya ve duktal tr hedeflenmesi teyit etmek için tüm meme bağlar hazırlanmasıyla bu basamağının gerçekleştirilmesi tavsiyeee. Buna ek olarak, reaktiflerin enjeksiyonu intraduktal tarif diğer protokoller uygun tekniği geliştirmek için yararlı olabilecek, 33,34 yayınlanmıştır. Duktal lümen viral hazırlanması veya enfeksiyonu olan sorunlar da bir MCherry ifade adenovirüs kullanılarak incelenmiştir olabilir. Enjeksiyon tekniği duruma kadar transjenik olmayan farelerdeki bu amaçlar her biri için kullanılabilir.
Herhangi bir meme bezi tümörleri başlatmak için kullanılabilir olsa da, biz bunu daha verimli hedefleme sonuçlanan bu bezlerin üzerinde uygun enjeksiyonları yapmak daha kolaydır çünkü inanıyorum meme bezi 4 veya 9, hedefleyerek en tutarlı büyüme oranları elde ettik kanal. Sol 4 th yakınlık veya drenaj kasık lenf düğümü doğru 9. inguinal meme bezleri, tümör ilerlemesi, farklı zamansal noktaları sırasında anti-tümör immün yanıtları incelemek için de yararlıdır. Distal siteleri modellemek ve gizli metastaz izlemek için transgenic fareler LSL-EYFP fareler ile geçti. Tümör ilerledikçe tümör katlanarak (Şekil 3A) büyümeye başlamadan önce, koltuk altı lenf düğümüne bağlanması tümör damar sistemi, en az yaklaşık 5 hafta tıkanmış hale gelir. Sonunda, 7-8 hafta sonra Lenfovasküler koltuk altı lenf düğümü (Şekiller 3A ve 3B) içinde tümör büyümesinin neden olur. Muhabiri fareler ve Kre-loxP teknolojisini kullanarak, YFP birleştirilmesi tümör ilerlemesi boyunca uzak bölgelere metastaz tümör hücreleri izlemek için bir platform oluşturur. Bu gizli metastaz teşvik hücresel ve epigenetik mekanizmaların tanıtılması amaçlanmıştır çalışmaları kolaylaştırabilir. Elimizde olanlar, göğüs tümörü hücre çizgileri duktal epitelyum hedeflenmesi teyit sitokeratin-8, mezotelin, östrojen reseptörü-α, ve HER2/neu ifade edilmiştir. Bununla birlikte, meydana mutasyonlara bağlı ve bağlı zorluk ve enjeksiyon değişkenliği olarak, öneririzModelin bir kez tümörler histolojik karakterizasyonu de laboratuarda kurulur.
Meme kanseri gibi ölümcül ve yaygın bir hastalıktır 1,2 olduğundan, doğru tümör ve ev sahibi arasındaki karmaşık etkileşimi recapitulate hayvan modelleri kullanmak önemlidir. Burada meme tümörü tamamen çaprazlanmış, C57BL / 6 fare modeli açıklar. İlk olarak, ana hücrelerden tümör uyararak biz tümör tam bağışıklık mikro doğal olarak gelişmeye izin verir. Gelişmiş fare göğüs tümörlerinde bağışıklık mikro-ortam genel olarak (Şekil 4), insan meme kanseri gözlenen αβ popülasyonları ve γδ T hücreleri, miyeloid türevi bastırıcı hücreler ve makrofajlar tartışıldı. Biz yumurtalık tümörleri ikna etmek için adenovirüs-Cre kullanarak önce yayınlanmış gibi, biz viral enjeksiyon gelen tümör infiltratların ve tümör ilerlemesi 28 üzerinde önemsiz bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur. İkinci olarak, bağımsız bir endokrinonkojenlerin ifadesi tümör hücreleri hedef gen ifadesinin sürekli yüksek düzeyde olmasını sağlar. Üçüncü olarak, gizli mutasyonlar yararlanarak, biz tümör evrim kesin zamansal izlemeyi kolaylaştırmak için Tümörgenez zamanlamasını kontrol edebilirsiniz. Bu modelin uygulamalar tümör hücresi biyolojisi hakkında araştırma, tümör mikro-, anti tümör immün yanıtları ve yeni terapötiklerin daha etkinliği değerlendirilmesinde faktörlere çalışmaları. Cre-loxP sisteminin durumu sayesinde, bu teknik, göğüs tümörlerinin başlatılmasında ve ilerlemesinde ek mutasyonlar çeşitli bir dizi araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir. Bu modelin kullanımı ile meme kanseri biyoloji anlayışı geliştirmek ve sonunda metastatik meme kanseri tedavisinde yönelik yeni terapötik yol umuyoruz.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NCI Bağış RO1CA157664 ve RO1CA124515 tarafından desteklenen ve Meme Kanseri Alliance ödül oldu. Biz Wistar Sitometrisi çekirdek tesisi, Wistar Görüntüleme tesisinden James Hayden, ve onların değerli teknik destek için Wistar Enstitüsü Hayvan Tesisi'nin tüm personel Jeffrey Faust, David Ambrose ve Scott Weiss teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Trp53tm1Brn transgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice |
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium | Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice | Jackson labs | 006148 | |
| Primers p53loxp/loxp | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3' |
|
| Primers LSL-K-ras G12D/+ | Integrated DNA Technologies | 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3' |
|
| Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3' |
|
| Primers for detection of Mesothelin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3' |
|
| Primers for detection of Progesterone Receptor expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3' |
|
| Primers for detection of Cytokeratin 8 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3' |
|
| Primers for detection of Erbb2 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3' |
|
| Primers for detection of Estrogen Receptor A expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3' |
|
| Primers for detection of Estrogen Receptor B expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3' |
|
| Primers for detection of B-Actin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3' |
|
| Adenovirus-CRE | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVCre | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
| Adenovirus-mCherry | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVmCherry | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
| Hamilton syringe | Hamilton company | 701RN | 10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
| Custom needle | Hamilton company | 7803-05 | 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
| Surgical forceps | Dumont | 52100-58 | Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving |
| MEM powder | Cellgro | 50 012 PB | Store at 4C in powder and reconstituted form |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233 | Add to MEM and filter stearilize |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | Minimum 96%, anhydrous |
Referencias
- Youlden, D., et al. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality. Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
- Sorlie, T., et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).
- Gatza, M., et al. A pathway-based classification of human breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).
- Bastien, R., et al. PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers. BMC Med. Genom. 5, 44 (2012).
- Montagna, E., et al. Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome. Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).
- Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy. J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).
- Rakha, E., et al. The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma. Cancer. 118, 3670-3680 (2012).
- Kim, I., Baek, S. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).
- Archer, T., et al. Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).
- Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region. EMBO J. 6, 363-368 (1987).
- Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids. Dev. Biol. , 327-337 (1990).
- Li, Y., et al. Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice. BMC Mol. Biol. 2, 2 (2001).
- Martelli, C., et al. In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras). Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).
- Klover, P. J., et al. Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden. Neoplasia. 12, 899-905 (2010).
- Moody, S. E., et al. Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis. Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).
- Banerji, S., et al. Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes. Nature. 486, 405-409 (2012).
- Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).
- Malaney, S., Daly, R. J. The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).
- Loboda, A., et al. A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors. BMC Med. Genomics. 3, 26 (2010).
- von Lintig, F. C., et al. Ras activation in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).
- Eckert, L. B., et al. Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis. Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).
- Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines. Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).
- Jackson, E., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).
- Scarlett, U., et al. Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells. Exp. Med. 209, 495-506 (2012).
- Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).
- Young, N., Crowley, D., Jacks, T. Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis. Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).
- Dinulescu, D., et al. Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer. Nat. Med. 11, 63-70 (2005).
- Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. J. Vis. Exp. , e4030 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).
