유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시
Summary
임상 적으로 전이성 유방암에서 유방 유관 시스템 결과에 아데노 바이러스 크레와 잠재 돌연변이의 활성화. YFP 발기인의 설립은 말초 전이성 종양 세포의 추적을 할 수 있습니다. 이 모델은 잠재 전이, 항 종양 면역, 유방암을 치료하는 새로운 면역 요법을 디자인을 공부하는 데 유용합니다.
Abstract
유방암은 결국 말단 조직 및 항 종양 면역의 붕괴 지수 종양의 성장과 전이의 결과로, 개발 종양과 면역 체계 사이의 복잡한 세포의 상호 작용을 포함하는 이기종 질병입니다. 많은 유용한 동물 모델은 유방암을 연구하기 위해 존재하지만, 아무도 완전히 인간에 발생하는 질병의 진행을 요점을 되풀이하지 않습니다. 잠상 전이의 형성을 초래할 및 감소 생존 세포 상호 작용의 더 나은 이해를 얻기 위해, 우리는 면역 능력 마우스에서 성적인 성숙 후에 개발 및 구동된다 YFP-발현 유관 암종의 유도 성 형질 전환 마우스 모델을 생성 한 일관성, 내분비 독립적 인 발암 유전자의 발현에 의해. YFP, p53의 절제의 활성화, 그리고 K-RAS의 종양 형태의 표현은 성적으로 성숙한 처녀 암컷 생쥐의 유방 덕트에 크레-재조합 효소를 발현하는 아데노 바이러스의 전달에 의해 달성되었다. 종양육주 종양 이벤트의 개시 후 나타나기 시작. 종양이 명확하게 한 후에 그들이 기하 급수적으로 성장을 시작하기 전에, 그들은 약 2 주 동안 천천히 진행. 7~8주 포스트 아데노 바이러스 주사 후 맥관은 원위 겨드랑이 림프절 YFP + 종양 세포의 최종 림프 침공, 말초 림프절 종양 질량을 연결 관찰된다. 침투 백혈구 인구는 αβ 및 γδ의 T 세포, 대 식세포 및 MDSCs의 존재를 포함하여 인간의 유방 암에서 발견되는 것과 유사하다. 이 독특한 모델은 침입 유방암을 치료하는 새로운 면역 개입을 설계하는 데 유용 할뿐만 잠재 전이 및 수면에 관련된 세포 및 면역 학적 메커니즘의 연구를 촉진 할 것이다.
Introduction
유방암은 세계 1,2 암 관련 사망 2의 두 번째 주요 원인에 걸쳐 여성에서 가장 일반적으로 발생하는 악성 종양이다. 복합 유전 3,4, 5 조직학 및 임상 표현형 6은 유방암의 다양한 아형을 특성화하기 위해 사용되며, 종종 생존 기간을 예측하는 수단으로서 사용된다. 유방암 여성의 큰 일대의 분석은 사망 환자 (약 80 %) 대부분이 기본 종양 7의 10 년 후 제거에서 재발 한 것으로 나타났다. 침윤성 암의 대부분의 경우, 림프 침공 강하게 가난한 결과와 질병 (8)의 공격적인 임상 경과에 상관 관계를 보여왔다.
때문에 유방암의 유전 적 표현형 복잡성, 질병의 전체 과정을 되풀이되었습니다 어떤 동물 모델이 없습니다. 인간 유방 종양 세포주가 자주 있었다이종 이식 또는 면역 결핍 생쥐의 침략 및 전이성 유방암의 소성을 9 모델로 사용된다. 유익한 비록 그것이 크로스 종 그래프트 때문에, 이러한 모델은 전체 종양 미세 환경의 영향을 왜곡 면역 압력의 부재하에 발생. 이러한 쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV)과 유청 산성 단백질 (WAP) 등의 유선 특이 적 프로모터에 의해 구동 유도 유전자 변이가 유방암의 유전 적 특성에 대한 지식의 엄청난 금액을 기여했다. 그러나, 이들 프로모터의 조직 특이 적 발현은 일반적으로 인간의 유방암에서 과발현되는 암 유전자의 발현을 반영하지 않는 유도 유전자 변이의 가변 식의 결과, 내분비 계 10-16 그들의 반응성에 의해 손상된다. 암 유전자의 MMTV 구동 식의 내분비 조절을 극복하기 위해, 무디 등. 가슴에 노를 과발현 조건, 독시 싸이클린 유도 모델을 생성상피 17. 이 모델은 회귀 분석과 재발을 연구하는 종양 형성 후 노를 deinducing 유용하지만 일관성, 장기 발암 유전자의 발현을 일정 독시사이클린 관리가 필요합니다. 사용할 수있는 다양한 관련 유방 종양 모델의 포괄적 인 논의는 Vargo-Gogola 등. (10)에 의해 검토에서 찾을 수 있습니다
우리의 목표는 전체 C57BL / 6 배경에 트레이스 유방암의 마우스 모델을 개발되었음을, 돌연변이 이벤트 모델 면역 압력의 존재하에 초기 종양 형성의 영구적 유도 후. 우리는 TP53의 floxed 대립, 그리고 K-RAS의 종양 형성하고, YFP를 포함하는 형질 전환 생쥐의 유방 덕트에 크레-재조합 효소를 발현하는 아데노 바이러스를 소개했다. 크레 식 TP53, 많은 유방암 18에 자주 변이 된 유전자를 절제 특히 YFP 표현뿐만 아니라 K-RAS의 종양 대립을 유도유방 유관 상피. K-라스의 돌연변이는 유방암 환자 19,20의 단지 6.5 %에서 발생하는, 유방암에서 자주 있지만, 그러한 인간 유방 종양에서 라스 신호 통로의 구성 적 활성에있어서 Her2/neu 및 EGFR 결과, 상류 키나제의 과발현 21-23. 많은 유방 종양 세포주에서 라스 신호 전달 경로의 활성화는도 24, 25을보고되었다. 우리는 종양 형성의 개시 및 성적 성숙, 처녀 암컷 생쥐에 크레-재조합 효소를 발현하는 아데노 바이러스의 췌관 내 주입의 기술을 설명합니다. 유방암의이 모델은 7 ~ 8 한달 겨드랑 림프절로 림프의 침략과 전이에, 느린 종양의 진행의 약 8 주 후에 기하 급수적으로 늘어날 명백한 병변을 개발하고 있습니다. 이 마우스가 전체 C57BL / 6 배경에 있습니다 및 YFP – 표현 종양 세포가 말초 림프절 추적하기 때문에,이 모델은 CE를 연구하는 중요한 도구를 제공합니다llular 및 면역 학적 잠재 성 전이의 메커니즘과 전이성 유관 유방암의 치료에 대한 새로운 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 절차의 성공은 훈련받지 않은 실험자에 대한 어려울 것이다, 췌관 내 주사시 적절한 기술에 달려있다. 우리의 실험실에서 경험이 풍부한 연구자는 일반적으로 유방 종양 대중에게 그들이 아데노 바이러스 주사를 관리하는 시간의 79 %를 얻을 수 있습니다. 주입에 문제가 상당히 지연, 변수 또는 결석 종양 개발 될 수 있습니다. 바늘이 너무 깊이 부적절한 각도로 삽입되어있는 경우, 유관 운하를 놓칠 수있다. 이는 유방 조직을 통해 복측 체강 액성 막으로의 침투를 방지하기 위해, 약간 바늘 (이하 2mm)의 경사를지나 젖꼭지를 입력하는 것이 중요하다. 또한, 바이러스 침전물의 이상 3 ㎖의 바늘이나 주사도 얕은 배치는 유선과 의도하지 않은 종양의 유도 외부 바이러스 준비의 유출이 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하는 한가지 방법은 약간 deepe 젖꼭지에 바늘을 삽입하는 것이다R 3mm, 천천히 경사의 끝에서 2mm까지 백업 덕트 중 주사기를 그려보다. 이는 유방 조직이 대신 마우스의 복강 (그림 1A)를 둘러싼 근육의 대상으로되어 있는지 확인합니다. 바이러스가 덕트로 토출 될 때, 바이러스 성 침전물 없음 누출 손실이 없도록 또한이 주사기의 가장자리 젖꼭지 스트레치 것이다.
주입의 시각화는 어렵고,이 단계에 대한 실천을 권장합니다. 우리는 종양 발달의 높은 penetrance 결과 실제로 다음 성공적인 주사의 증가를 관찰 하였다. 이 기술은 처녀 암컷 nonlactating 사용하기 때문에 기본 덕트 운하를 공개 젖꼭지를 덮고있는 각질 플러그를 제거하는 것이 중요합니다. 우리는 덕트의 내부에 트리 판 블루 또는 다른 멸균 추적 염료를 주입하고 유관 TR의 대상 확인하는 전체 유방 마운트를 준비하여이 단계를 연습하는 것이 좋습니다EE. 또한, 시약의 췌관 내 주입을 설명하는 다른 프로토콜은 적절한 기술을 개발하는 데 유용 할 수있는, 33, 34을 발표되었다. 유관 루멘의 바이러스 준비 또는 감염 문제도 mCherry 표현하는 아데노 바이러스를 사용하여 조사 할 수있다. 사출 기술이 최적화 될 때까지 비 형질 전환 마우스는 이들 목적들 각각에 대해 사용될 수있다.
모든 유선 종양을 시작하는 데 사용 할 수 있지만, 우리는 우리가보다 효율적으로 타겟팅의 결과로, 이러한 분비에 적절한 주사를 수행하는 것이 더 쉽습니다 때문에 믿고 유선 3 또는 9를 대상으로 가장 일관된 성장률을 달성 덕트. 왼쪽 4 번째의 근접 또는 배수 서혜부 림프절에 바로 9 번째 사타구니 젖샘 종양 진행의 서로 다른 시간 점 중 항 종양 면역 반응을 검사하는 것이 유용합니다. 원심 사이트를 모델링에 잠재 전이를 추적하기 위해 transgenic 마우스는 LSL – EYFP 마우스 교차했다. 종양이 진행되면서 종양이 기하 급수적으로 (그림 3A)을 성장하기 시작하기 전에, 겨드랑 림프절에 종양을 연결하는 혈관은 약 오주 약간 부풀어 오른 될 것입니다. 결국 7-8 주 후에, 림프 침공 겨드랑 림프절 (그림 3a 및 3b)에서 종양의 성장에 발생합니다. 리포터 생쥐 및 크레에 loxP-기술을 사용하여, YFP 혼입는 종양 진행을 통하여 원위 사이트로 연결을 전이 종양 세포를 추적하는 플랫폼을 생성한다. 이는 잠상 전이를 촉진 셀룰러 및 후생 유전 학적 메카니즘 해명을 목표로 연구를 촉진 할 수있다. 우리 손에, 유방 종양 세포 라인은 유관 상피의 대상 확인, 아세포-8, mesothelin, 에스트로겐 수용체-α 및 Her2/neu와를 표명했다. 그러나, 유도 된 돌연변이에 인한 어려움과 주사의 변화에 따라, 우리는 추천모델 번 종양의 조직 학적 특성은 물론 실험실에서 확립된다.
유방암 같은 치명적인 질환 및 퍼베이시브 1,2이므로, 정확하게 종양 및 호스트 사이의 복잡한 상호 작용을 다시 요약 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 유방 종양의 완전 backcrossed C57BL / 6 쥐 모델을 설명합니다. 첫째, 원시 세포에서 종양을 유도하여, 우리는 종양 전체 면역 미세 환경에서 자연적으로 진화 할 수 있습니다. 고급 마우스 유방 종양의 면역 미세 환경은 일반적으로 (그림 4) 인간의 유방암에서 관찰 된 αβ의 인구와 γδ T 세포, 골수 유래 억제 세포, 대 식세포를 되풀이되었습니다. 우리가 난소 종양을 유발하는 아데노 바이러스 크레을 사용하여 이전에 게시 한 바와 같이, 우리는 바이러스 감염이 해당 종양의 침윤과 종양의 진행 28 무시할 영향을 미쳤다 것으로 나타났습니다. 둘째, 내분비 독립암 유전자의 발현은 종양 세포가 표적 유전자의 발현 수준을 지속적으로 높은 것을 보장한다. 셋째, 잠재 성 돌연변이를 활용하여, 우리는 종양 진화의 정확한 시간 추적을 용이하게하기 위해 종양 발생의 타이밍을 제어 할 수있다. 이 모델의 응용 프로그램은 종양 세포 생물학에 대한 연구를 포함, 종양 미세 환경, 항 종양 면역 반응, 새로운 치료제의 효능도 평가 요인에 대한 연구. 크레-에 loxP 시스템의 가용성을 통해,이 기술은 유방 종양의 개시 및 진행에 추가적인 돌연변이의 다양한 배열을 조사하기위한 플랫폼으로 사용될 수있다. 우리는이 모델의 사용은 유방암의 생물학에 대한 이해를 향상시키고 궁극적으로 전이성 유방암을 치료하기위한 새로운 치료로 이어질 수 있기를 바랍니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NCI 보조금 RO1CA157664 및 RO1CA124515에서 지원하고, 유방암 얼라이언스 수상했다. 우리는 위 스타 유동 세포 계측법 핵심 시설, 위 스타 이미징 시설에서 제임스 헤이든, 그들의 귀중한 기술 지원을 위 스타 연구소 동물 시설의 전체 직원의 제프리 파우스트, 데이비드 암브로스, 스콧 와이즈에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Trp53tm1Brn transgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice |
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium | Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice | Jackson labs | 006148 | |
| Primers p53loxp/loxp | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3' |
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| Primers LSL-K-ras G12D/+ | Integrated DNA Technologies | 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3' |
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| Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3' |
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| Primers for detection of Mesothelin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3' |
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| Primers for detection of Progesterone Receptor expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3' |
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| Primers for detection of Cytokeratin 8 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3' |
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| Primers for detection of Erbb2 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3' |
|
| Primers for detection of Estrogen Receptor A expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3' |
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| Primers for detection of Estrogen Receptor B expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3' |
|
| Primers for detection of B-Actin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3' |
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| Adenovirus-CRE | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVCre | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
| Adenovirus-mCherry | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVmCherry | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
| Hamilton syringe | Hamilton company | 701RN | 10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
| Custom needle | Hamilton company | 7803-05 | 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
| Surgical forceps | Dumont | 52100-58 | Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving |
| MEM powder | Cellgro | 50 012 PB | Store at 4C in powder and reconstituted form |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233 | Add to MEM and filter stearilize |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | Minimum 96%, anhydrous |
Referencias
- Youlden, D., et al. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality. Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
- Sorlie, T., et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).
- Gatza, M., et al. A pathway-based classification of human breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).
- Bastien, R., et al. PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers. BMC Med. Genom. 5, 44 (2012).
- Montagna, E., et al. Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome. Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).
- Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy. J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).
- Rakha, E., et al. The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma. Cancer. 118, 3670-3680 (2012).
- Kim, I., Baek, S. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).
- Archer, T., et al. Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).
- Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region. EMBO J. 6, 363-368 (1987).
- Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids. Dev. Biol. , 327-337 (1990).
- Li, Y., et al. Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice. BMC Mol. Biol. 2, 2 (2001).
- Martelli, C., et al. In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras). Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).
- Klover, P. J., et al. Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden. Neoplasia. 12, 899-905 (2010).
- Moody, S. E., et al. Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis. Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).
- Banerji, S., et al. Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes. Nature. 486, 405-409 (2012).
- Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).
- Malaney, S., Daly, R. J. The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).
- Loboda, A., et al. A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors. BMC Med. Genomics. 3, 26 (2010).
- von Lintig, F. C., et al. Ras activation in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).
- Eckert, L. B., et al. Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis. Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).
- Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines. Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).
- Jackson, E., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).
- Scarlett, U., et al. Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells. Exp. Med. 209, 495-506 (2012).
- Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).
- Young, N., Crowley, D., Jacks, T. Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis. Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).
- Dinulescu, D., et al. Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer. Nat. Med. 11, 63-70 (2005).
- Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. J. Vis. Exp. , e4030 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).
