乳腺癌的一种新的转基因小鼠模型：转移性乳腺癌通过瞄准导管上皮与腺病毒Cre重组酶的启动

所有的动物实验已获Wistar研究所动物护理和使用委员会。 1。转基因小鼠的产生和维护繁殖LSL-K-ras基因tm4Tyj 26和TRP53 tm1Brn 27（从上一个混合的背景人类癌症协会的NCI小鼠模型得到的），以一个完整的C57BL / 6背景28通过回交至少10代与C57BL / 6小鼠。要跟踪肿瘤转移，培育B6.129X1-GT（ROSA）26Sor TM1（EYFP）产地来源证 / J（LSL-EYFP，从杰克逊实验室在一个完整的C57BL / 6背景获得）与双转基因LSL-K-ras基因G12D / + P53 的loxP / loxP小鼠。 注意：转基因LSL-K-ras基因G12D / + p53基因的loxP / loxP小鼠有loxP位点侧翼的致癌基因K-ras基因和内源性的p53基因座的转录沉默的等位基因，从而当Cre重组酶介导的切除，致癌K-ras基因的过表达突变和p53的消融是阿智eved。 注意：LSL-EYFP小鼠包含一个终止密码子侧翼的基因对于增强型黄色荧光蛋白（YFP），该经Cre重组酶介导的切除导致YFP在那里的YFP停止盒被切除的组织中的表达。 培育转基因小鼠获得LSL-K-ras基因G12D / + p53基因的loxP / loxP小鼠或LSL-K-ras基因G12D / + p53基因的loxP / loxP位 LSL-EYFP老鼠导管内注射。 注：小鼠LSL-K-ras基因G12D / +，因为小鼠纯合缺失的K-ras的死在子宫内繁殖的纯合子p53基因的loxP / loxP位和杂。用天真的处女雌至少六个星期大的导管内注射。 注意：该引物进行基因分型的纯合子两侧装接loxP的p53等位基因是p53基因- T010-FWD（5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'）和p53-T011-反向（5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'）。他们生产的野生型等位基因在391 bp和p53基因在461 bp的29,30两侧装接loxP等位基因。 注意：用于检测K-ras基因的突变形式的引物是oIMR8273（5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'）和oIMR8274（5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'）。它们产生于600bp的检测突变带。 注意：对于YFP记者三重转基因小鼠中，引物以检测ROSA盒（5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'），野生型等位基因（5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'），和一个共享等位基因（5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT 3'），导致频带在320 bp处两侧装接loxP的等位基因和600 bp的野生型等位基因扩增。 2。手术准备洁净手术材料用75％的乙醇和之前和之后的所有注射​​高压灭菌。 在一个干净整洁的实验室长凳内的动物设施经过消毒室进行手术。擦拭所有表面，包括手术显微镜具有广谱消毒剂溶液，然后用75％乙醇的阶段和拨号。 称重并通过腹膜内注射氯胺酮（80-100毫克/千克）和赛拉嗪（8-10毫克/千克）在无菌盐水的混合物的麻醉小鼠。 轻轻将小鼠放回笼子里静置5分钟，而他们去麻醉下。在这段时间内产生的病毒沉淀物（见协议3）。 验证缺乏对疼痛的反应由脚趾捏的。轻轻覆盖麻醉小鼠的眼睛兽医药膏，以防止过度角膜干燥。 为了防止体温过低，将麻醉小鼠到一个加热垫在手术过程中设置为低热量 ，直到他们开始复苏。 对于疼痛的管理，管理的小鼠皮下美洛昔康在1毫克/千克的手术和24小时前后。 3。病毒沉淀物的生成 注意：腺病毒载体，虽然它们已被修改，无法复制，带来的风险感染。腺病毒处理谨慎。所有人员应根据处理BSL2剂导管内注射后，按照BSL2规定进行处置腺病毒的机构的指导方针进行适当的培训。 店铺腺病毒浓缩病毒储存在-80℃下冻结的每个4×10 8 pfu的，足够的等分试样注入16动物用3ml的腺病毒颗粒的2.5×10 7 pfu的。 储存干冰腺病毒等分，直到开始注射前约15-20分钟。 注意：避免反复冻融，病毒滴度每个周期之间的显著下降。 注：腺病毒沉淀物通过修改协议形成之前31说明。 重建504毫克MEM粉末用50ml无菌分子级水，补充有244毫克碳酸氢钠和过滤器在无菌条件下并储存于4℃。 <立>通过加入1.5克氯化钙至50ml的分子级水过滤器和在无菌条件下并储存在4℃下制备的氯化钙溶液混合含有4×10 8 pfu的腺病毒Cre重组酶在无菌水足3％蔗糖为10毫升的最终体积等分试样。添加34毫升MEM的病毒，轻轻混匀。然后加入4毫升的CaCl 2溶液中，轻轻混合，并在室温下孵育15-20分钟。 腺病毒储存干冰，直到准备形成沉淀。避免了腺病毒的解冻并存储在冰上或室温下延长的时间，除非沉淀物的形成。 注意：也可以混合使用蔗糖，MEM和氯化钙2之前的手术，如果它是不可能的解冻腺病毒等分并开始制作除去从-80℃后，立即沉淀蔗糖，MEM，和钙的等分试样可以保存在干冰，直到准备添加的腺病毒。 注意：病毒颗粒是稳定约1小时。 在此之前每次注射，轻轻一抖管，以确保病毒颗粒混合。拟定病毒颗粒3毫升（2.5×10 7 PFU）到10 ml注射器，并准备进行鼠标的导管内注入。 4。病毒颗粒导管内注入轻轻将鼠标放在其返回到一个干净的解剖显微镜的照明阶段。照亮腹部侧与一个额外的光源和皮草围绕每个乳头的白色小斑块（在C57BL / 6雌性可见）定位左侧4 个或向右9 日腹股沟乳腺。 用无菌乙醇浸泡棉花轻轻擦乳头涂药器，以清除从乳头头发和消毒注射部位。如果他们是很难找到，轻轻涂抹一层厚厚的脱毛膏或使用剪刀，露出乳头。 </l我> 除去角栓 ，一层致密的死皮细胞，其覆盖所述奶嘴。一旦乳头露出，角质栓必须容易看到的解剖显微镜下。 固定乳头用细手术钳，拉光力以去除角栓。 稳定钳之间的乳头。 轻轻插入镊子之间的针，cannulating管道管90°。进入乳头微微过去的针（未超过2mm）的斜面，以防止渗透通过乳房组织和成腹侧体腔的浆膜。 不要插入针过深。为了确保注射适当的深度，将其插入导管管腔后轻轻拉出针上，绘制乳头向上沿针的边缘，因为它是拉高。 注意：在注射可视化是困难的，因此实用篇PracticE的这一步是使用台盼蓝推荐。 当针被适当地放置到乳腺导管，释放3毫升病毒沉淀物（2.5×10 7 pfu的腺病毒Cre重组酶的），轻轻推插与手握住注射器的拇指注射器。乳头应略微膨胀的液体被添加。 5。恢复小鼠将小鼠放回注射后的加热垫，直到它开始从麻醉中恢复过来。 当鼠标被收回，把它重新放入干净的笼子和监测全面复苏和运动。 24小时的导管内注射后，皮下给药美洛昔康在1毫克/千克。 6。监测肿瘤进展触诊注入乳腺第30天为扩大和肿胀。 监测肿瘤进展每5-7天一次，肿胀，增大乳腺格兰d被观察到。 测量肿瘤体积每3-4天对肿瘤生长动力学一度触及的肿瘤出现（约50-60天后腺病毒注射液）。 安乐死的小鼠时，肿瘤体积超过的小鼠体重的10％。