JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Визуализация иммунологических синапсов на двойной цвет времени закрытого вынужденного излучения истощения (STED) Наноскопия

Published: March 24, 2014
doi:
10.3791/51100
,
1Center for Human Immunobiology,Texas Children’s Hospital and Baylor College of Medicine

Summary

Здесь мы проиллюстрируем протокол для работы с изображениями на двухцветной STED Наноскопии цитотоксический иммунный синапс киллеров воспроизводятся на стекле. С помощью этого метода мы получим разрешение суб-100 нм синапса белков и цитоскелета.

Abstract

Природные клетки-киллеры образуют жестко регулируется, точно настроенные иммунологические синапсы (IS) для того, чтобы лизировать инфицированные вирусом или онкогенных клеток. Динамические реорганизации актина является критическим для функции NK-клеток и формирование ИС. Визуализация F-актина в синапсах традиционно используется конфокальной микроскопии, однако дифракционный предел света ограничивает разрешение флуоресцентной микроскопии, в том числе конфокальной, примерно 200 нм. Последние достижения в области технологий визуализации позволили развитие subdiffraction ограниченной изображений сверхвысокого разрешения. Для того чтобы визуализировать F-актин архитектуру в том, что мы резюмировать НК клеток цитотоксической синапс, придерживаясь NK клетки активирующий рецептор на стекле. Мы тогда изображение белки интерес, используя двухцветную стимулировали истощения выбросов микроскопии (STED). Это приводит к <80 нм резолюции в синапсах. Здесь мы опишем этапы пробоподготовки и приобретения изображений с помощью двойной цвили STED наноскопия визуализировать F-актин в НК. Мы также иллюстрируют оптимизацию приобретения образца с помощью Leica SP8 программное обеспечение и время закрытого STED. Наконец, мы используем Гюйгенса программное обеспечение для постобработки деконволюции изображений.

Introduction

Иммунологических синапсов является сложной среде белки и цитоскелета элементы сигнализации. Цитолитическая синапс был первоначально описан как имеющий "бычий глаз", как структуры с кольцом актина и адгезии молекул, окружающих центральную область секреторную 1-4. Тем не менее, теперь мы знаем, что он состоит из микроскопических областей активного сигнализации, которые требуют непрерывного динамического цитоскелета реорганизации для функции 5-11. Большая часть информации, что у нас теперь есть о синапса, была получена из микроскопии и иммунологи были лидерами в области технологий визуализации передовые.

Одним из таких новая технология супер-разрешения микроскопии. Обычные световой микроскопии пространственно ограничена дифракционной барьер света, который устанавливает нижний предел разрешения для всех флуоресцентной микроскопии, в том числе конфокальной года, примерно в 200 нм. В последние годы некоторые методы были заниматься разработкамиг, что позволит разрешение ниже дифракционного барьера. К ним относятся стимуляции выбросов истощения микроскопии (STED), структурированный освещения микроскопии (SIM), стохастически решен микроскопии (STORM), и Фотоактивируемые световой микроскопии (Palm). Эти методы были подробно рассмотрены в другом месте 12-15, но изложены ниже. Subdiffraction ограниченное разрешение генерируется уникальными способами в каждой системе. Выбор методики сверхвысокого разрешения, следовательно, должны быть продиктованы эксперимента и экспериментальной системы интересов.

STED супер разрешение достигается с помощью высокой интенсивности тороидальный истощения луч, который избирательно "молчание" флуоресценции вокруг каждого флуорофором интереса при возбуждении, в результате чего subdiffraction ограниченной флуоресцентной микроскопии 16-18. Одним из преимуществ является то, что STED получения изображения является быстрым и требует относительно небольших пост-обработку. В то время как выбор красителя диктуется спецификацииТрал положение обеднения пучка, в коммерчески доступных системе расположенного на 592 нм, несколько коммерчески доступные красители доступны, что делает комбинации двух флуорофоров возможно. Кроме того, обычно используемые флуоресцентные репортеры, такие как GFP может быть отображены, делая эксперименты живые клеточные можно 19,20.

Ранее мы уже использовали STED выявить и количественно регионы F-актина hypodensity, которые используются на киллеров для дегрануляции 21,22. Мы полагаем, что STED является хорошим выбором для работы с изображениями иммунную синапс из-за его относительно гибкого наличия флуорофорами и превосходное улучшение разрешения по оси ху. Кроме того, на коммерчески доступной системы STED, используемого для этих экспериментах использование высокоскоростной (12000 Гц) резонансного сканера позволяет быстро приобретения изображений с минимальным повреждением образцов. Общество с ограниченной гибкости в выборе красителя считается недостатком STED 12,Однако двухцветный STED относительно проста с несколькими коммерчески доступных флуорофоров. Интеграция STED с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии также обеспечивает дополнительную конфокальной микроскопии в сочетании с STED, так что пока STED ограничивается двумя каналами, дополнительные структуры могут быть отображены в конфокальной с разрешением примерно 200 нм (Е. Мейс, неопубликованные наблюдения ). В то время как мы описали использование STED для работы с изображениями иммунные клетки, эта технология применяется в различных типах клеток, включая нервные клетки, и для визуализации различных клеточных структур 23-26.

SIM использует другой подход для создания subdiffraction ограниченной изображения. Визуализируя известные закономерности периодического воздействия, информация может быть получена о неизвестной структуры изучаемого следующие математического преобразования 27. Это дает увеличение разрешения до ~ 100 нм с боков 28,29. Преимущество SIM является то, что яы совместимы всеми стандартными конфокальных красителей и зондов Однако недостатком является гораздо медленнее получать изображения и них требуют длительный постобработку +12. Это также ограничивает его использование для визуализации живых клеток.

Наконец, изображения супер-разрешения могут быть получены путем стохастического фото-коммутации флуорофорами. Этот подход эксплуатируется в фото-активированный локализации микроскопии (PALM) и стохастический микроскопии Оптический реконструкция (STORM). При сканировании нескольких камер кадров и локализации случайно активированные молекулы, которые превратили "на" и "OFF" в течение долгого времени, изображения с разрешением 20-30 нм, сгенерированы исходя из накопленных кадров 30-32. Компромисс за эту резолюцию является время, необходимое для получения изображений.

Здесь мы показываем, в деталях, протокол для подготовки и визуализации образцы двухцветный в STED. В этой системе возбуждения с импульсным, перестраиваемого лазера, светло-белого. Из-за природыпучка импульсного возбуждения, время стробирования обнаружения стало возможным и дальнейшее увеличение разрешения. Кроме того, система оснащена гадолиния гибрид (HYD) детекторов, которые более чувствительны, чем обычные фотоумножителями, что позволяет обеспечить более низкими требованиями мощности лазера. Обеднения пучка для STED применяется постоянно и настроен на 592 нм, что будет диктовать выбор красителей, доступных для двух цветовых STED. Комбинации Часто используемые красителя обычно включают один возбудимую на 488 нм (например, Alexa Fluor 488, Орегон Green, DyLights зеленых или Chromeo 488) и один возбудимую на 458 нм (например, Тихого Orange или Horizon V500). Таким образом, в то время как обнаружение двух красителей будет таким же диапазона (и оба доступны от обедненного лазера), возбуждение будет происходить с различными длинами волн. С перестраиваемой белый свет лазерных и перестраиваемых детекторов, увеличивая сигнал, устраняя спектральный перекрытие производится довольно легко. Таким образом, мы имели хороший успех с комбинатИоны коммерчески доступных красители, такие как тихоокеанского оранжевой и Alexa Fluor 488 (используемый здесь). Наш протокол адаптирован к и описывает оценку человеческих клеток NK, как, представляющий историческую направленность нашей лаборатории. Мы специально использованием клеточной линии NK92 в этом примере, как и тот, который мы регулярно применяется в нашей экспериментальной работы 21,33.

Protocol

1. Пальто Покровные с антителами Prewarm (при 37 ° С) 30 мл RPMI 10% FCS СМИ и 1 мл BD Cytofix / Cytoperm. Готовят раствор 5 мкг / мл очищенного антитела в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Для активации клеточной линии NK92, использование анти-CD18 и анти-NKp30 рекомендуется. Отметьте один примерно десять центов размера круг для каждого условия на # 1,5 покровного использованием PAP ручку. Для двойного эксперимента цвета, должно быть четыре условия: неокрашенных, двойной окрашенных и две односпальные окрашенных условия. Разлить 200 мкл раствора антител в каждой области и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Вымойте покровные, осторожно погружая каждый в 50 мл PBS в 50 мл коническую трубку при комнатной температуре. Стиральная должно происходить непосредственно перед добавлением клеток и следует позаботиться, чтобы избежать антител сушки на покровное. 2. Активируйте киллеров на обложкескользит; Fix и проницаемыми Изолировать 5 х 10 5 NK92 клеток на состоянии. Центрифуга и сцеживать супернатант. Вымойте один раз 10 мл нагретого СМИ из стадии 1.1. Центрифуга и сцеживать супернатант. Ресуспендируют клеток в предварительно нагретой СМИ из стадии 1.1 в концентрации 2,5 х 10 6 / мл. Аккуратно слейте 200 мкл в центре региона, созданного в разделе 1.2.1. Инкубировать при 37 ° С в течение 20 мин при 5% CO 2. (Примечание: на этот раз может быть продлен или уменьшается в зависимости от биологической функции, представляющие интерес для НК клеток гранул поляризации, 20 мин достаточно.). После инкубации клетки осторожно мыть покровные путем погружения каждый в 50 мл PBS при комнатной температуре в 50 мл коническую пробирку. Добавить 1 мкл Triton X-100 в 1 мл нагретого раствора Fix / Пермский со стадии 1.1 и вихря тщательно. Fix и проницаемыми, добавив 200 мкл Fix / Пермский буфера (шаг 2.3) к клеткам. Выдержите в течение 10 м.в в темноте при комнатной температуре. 3. Пятно Клетки Подготовка окрашивающего буфера: забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 1% БСА, 0,1% сапонина. Подготовьте решение первичного антитела в 200 мкл окрашивание буфер (см. шаг 3.1). (Примечание: антитело следует титровать до использования). Избегайте использования первичных антител, которое возникает в тех же видов, используемых для покрытия покровное (шаг 1.2). Также избегайте Strepatividin-биотин связей для работы с изображениями STED. После разделе 2.3.1, аккуратно мыть покровные в 50 мл окрашивающего буфера. Приложите края ПАП-пера региона с ватным тампоном, чтобы удалить лишнюю буфер. Нанесите раствор антител, созданный в разделе 3.1.1. Выдержите 30 минут в темноте при комнатной температуре. (Рекомендуется: инкубировать покровные в окне слайд влажной бумажной салфеткой, чтобы поддерживать влажность). Подготовьте решение вторичным антителом в 200 мкл окрашиваниебуфера. Рекомендуемые флуорофоры являются Alexa Fluor 488, Тихоокеанский Оранжевый и V500. Как правило, разбавление 1:200 подходит для работы с изображениями STED. Осторожно промыть покровные в 50 мл окрашивающего буфера. Приложите края ПАП-пера региона с ватным тампоном, чтобы удалить лишнюю буфер. Нанесите раствор вторичного антитела. Выдержите 30 минут в темноте при комнатной температуре. Повторите промывку и окрашивание для дополнительных белков, представляющих интерес. Если обнаружение F-актина с фаллоидином, это может быть включено с вторичным антителом, обычно при разведении 1:200. 4. Гора Покровные на слайдах Подготовьте монтажную среду. Примечание: к затягиванию или Продлить Золото, являются предпочтительными. Vectashield следует избегать, так как он не совместим с STED. 2,2-thiodioethanol следует избегать, если фаллоидином используется. Mowiol является приемлемым. Поместите приблизительно 10-20 мкл монтажа среду на слайде. Обратить покровное (ячейка стороной вниз) и смонтировать покровное мягко, заботясь, чтобыизбежать введения пузырьков воздуха. Выдержите слайды в течение 24 часов (покровное вверх) до визуализации. Уплотнение края покровного стекла с лаком для ногтей. 5. Экспериментальная установка Инициировать необходимые лазеры и программного обеспечения. Инициировать истощения лазер STED на 100% мощности. Выравнивание STED лазер, который в случае коммерческих систем часто является автоматизированной процедуры. Фокус образца, начиная с одного цветного контроля, на микроскопе, используя окуляры. 6. Оптимизация настройки Сканирование первый канал и оптимизировать мощность лазера, положение луча возбуждения и диапазон детектора. По возможности избегайте прирост> 100. Снимайте в конфокальной оптимизировать настройки. Линия и / или рамы усреднение будет увеличить разрешение. Проверьте насыщения пикселей. Примечание: Некоторые насыщения приемлемо в конфокальной как применение STED снизит интенсивность излучения. Для STED, оптимальный размер пикселя будет ниже 30 нм, каквсе лучшее разрешение будет получено с меньших размеров пикселя. Размер области, представляющей интерес которая отображается будут диктовать нижний предел размера пикселя. Меньшие размеры пикселя может увеличить фотообесцвечивания. Применить STED истощения луч и образ записи, начиная с 50% истощения мощности лазера. Если улучшенное разрешение видно, более истощение мощность лазера может быть применен. На этой стадии может быть необходимо регулировать мощность лазера возбуждения, линии среднего, и / или усиления. Применить времени стробирования для уменьшения фона (минимум 0,3 нс). Настройка параметров пока улучшение в резолюции по конфокальной не видно. Разрешение можно приблизить оценки полную ширину половину максимума (FWHM). Это представляет собой расстояние в половину максимальной интенсивностью гауссовского пика созданной рисования профиль линии по структуре интерес, и является широко используемым методом оценки разрешение. После того, как первый канал является удовлетворительным, инициировать вторую последовательность для SEили косвенные сканирования. В общем, лучше всего сканировать длительный флуорофором длины волны в первую очередь. Повторите шаг 6.1 на втором канале. Подтвердите отсутствие спектральной перекрытия по визуализации одиночных окрашенных управления с обеих последовательностей сканирования. Мягкий спектральная перекрытия могут быть исправлены с использованием спектральных ООН-смешивания функций в программном обеспечении, однако следует избегать, где это возможно. 7. Приобретение изображения Получение изображений. Для количественного изображений, рекомендуется, чтобы получить по крайней мере 20 изображений / состояние. Точное число, однако, должны быть определены в соответствии с экспериментальной вопрос в концерте с статистического подхода, таких как расчет размера выборки. Сохранить эксперимент. 8. Деконволюция Открыть файл с деконволюции программного обеспечения или пакетного процессора. Проверьте параметры для каждого канала с помощью программного обеспечения. Подтвердите спектры возбуждения и излучения каждого канала, STED истощения эмиссию и изображений дирекуравнение (вверх или вниз, если изображение 3-мерного) в частности. Деконволюции с помощью мастера деконволюции. Настройки по умолчанию в целом являются адекватными, однако отношение сигнал-шум (SNTR) будет варьироваться от флуорофором чтобы флуорофором и должны быть определены для каждого канала и каждого эксперимента индивидуально.

Representative Results

Очевидно, что одной из главных целей супер-разрешением изображения будет улучшение по сравнению с обычными конфокальной микроскопии. Тем не менее, есть некоторые общие подводные камни, которые могут привести к недостаточному резолюции. Они требуют, чтобы каждый эксперимент быть оптимизирована индивидуально. В нашем репрезентативного эксперимента, мы визуализации F-актин сеть в клетке НК активированного антитела, связанного с стекла. Общие причины (и поправки на) отсутствия улучшения разрешения STED над конфокальной являются: Под-выборки (рис. 1а). Это может привести к зернистости и потери информации пикселя, как показано на плохое разрешение F-актина. Увеличение линии или рамки усреднения часто может исправить это. Отбеливание и / или избыточной дискретизации (рис. 1b). Это может быть вызвано длительным временем задержки пикселя в результате чрезмерного усреднения линии. С другой стороны, это может быть результатом чрезмерного развертку изображения до приобретения, в том числе чрезмерное использованиеистощение лазера. Это обычно приводит к туманных или нечетких изображений. Это можно исправить путем сканирования поле интереса только минимально до приобретения или, если возможно, увеличивая скорость лазерного сканирования. Если проблема не устраняется, истощение мощность лазера может быть снижена. По достижении правильный баланс времени пиксель выдержки, возбуждения мощности лазера и истощения мощности лазера, изображение с улучшенным разрешением и достаточной информации могут быть получены (рис. 1в). Разрешение может быть дополнительно улучшена за счет использования деконволюции (рис. 1d). Когда приобретение оптимизирован, деконволюция улучшит разрешение и качественно и количественно и разрешение суб-100 нм должен быть регулярно достижима. Рисунок 1. Оптимизация приобретения и распространенных ошибок STED изображений. NK92 клетки активировали на стекла, покрытого анти-CD18 и-NKp30 на 20 мин, затем фиксированной, проницаемыми и окрашивали для F-актина с фаллоидином Alexa Fluor 488.) Пример потеря информации об изображении в связи с под-выборки. б) пример потери разрешения в связи с отбеливание / избыточной дискретизации с) условий оптимизирован D), оптимизированные условия приводят к большим улучшением в резолюции с деконволюции. Шкала бар = 5 мкм.

Discussion

Улучшение в резолюции по конфокальной будет несколько зависит от факторов, которые не могут управляться. Эти факторы включают в себя незначительные аберрации в крышке толщиной скольжения и несоответствий в монтажных СМИ. Важно, чтобы поддерживать температуру и влажность в помещении изображения как можно более последовательными, и луч STED следует перестроила примерно каждые 60 минут. Как уже упоминалось в процедурах, использование Vectashield монтажной среды следует избегать, так как это не совместимо с STED. Кроме того, к которому следует всегда использовать # 1.5 покровные стекла, и если возможно, используйте те, которые были проверены в определенной толщины.

Один модификация изложенного подхода заключается в графических дополнительных каналов в конфокальной, используя флуорофоры, которые излучают на большей длине волны, чем пучка STED. Таким образом, можно изображение до четырех каналов (двух в конфокальной, двух в STED). Если принимать этот подход, однако, каналы с флуорофорами еmitting выше обедненного лазера STED должны быть отображены первые, как приложение пучка STED будет истощать фотоны в этих каналах. Одним из преимуществ этого метода является применение временного стробирования, который также улучшит разрешение в конфокальной, устраняя излучение фотонов с коротким сроком службы 34. В частности, использование временного стробирования, сроках детекторов излучения переписки с импульсного возбуждения STED, будет уменьшаться фоновой флуоресценции от отражения от покровного стекла при визуализации близко к нему. Даже в эксперименте не подходит для STED, при использовании импульсного источника возбуждения, время стробирования может быть полезным инструментом для улучшения разрешения в конфокальной.

Существуют различные модификации, которые могут быть использованы для улучшения разрешения в STED. Одним из них является, чтобы уменьшить размер точечным от стандартного блока 1 Эри, хотя это также уменьшает количество света, попадающего на образец. Это может быть компенсировано увеличением ласьэ питания или усиления. Другой состоит в увеличении линии средней, что позволит увеличить количество информации, собранной для каждого фотона, повышение разрешения. Опять же, однако, это может быть за счет фотообесцвечивания образца, так что баланс необходимо будет заключена между разрешением и отбеливания. Точно так же, использование флуоресцентных белков, таких как GFP потребует тщательной оптимизации, чтобы избежать обесцвечивания. Это может быть достигнуто путем уменьшения мощности лазера STED если это необходимо. Также позволит более длительных большей восстановления фотонов и уменьшить обесцвечивание. Поправка на фотообесцвечивания должны учитываться при анализе живой STED.

Конечно, работы с изображениями в 3-х измерениях в STED Также возможно, и также даст улучшение по сравнению с обычным изображений конфокальной. Это особенно верно, если это делается в сочетании с деконволюции, хотя следует соблюдать осторожность для коррекции дрейфа, который происходит во время съемки несколько плоскостей в оси. При использовании программного обеспечения Гюйгенсак деконволюции, эта поправка получается с помощью "стабилизации изображения" функцию. Используя этот подход, разрешение в оси будет улучшена. Это является большим шагом вперед по сравнению с обычными конфокальной микроскопии, который имеет плохое разрешение осевой, и даже более просто, STED себя, который также имеет относительно слабую резолюцию ось г. В то время как приобретение несколько стеков в STED, необходимо позаботиться, чтобы избежать обесцвечивания образца, а при необходимости можно уменьшить линии усреднение или энергоемкость лазера для того, чтобы сделать это. Опять же, следует отметить, что если Imaging Другие флуорофоров, которые не подходят для STED, применение обедненного пучка в первом последовательном сканировании будет предотвращать выброс из этих каналов. Таким образом, смешанный подход STED / конфокальной (при использовании сканирующей конфокальной в каналах, которые излучают на длине волны большей, чем 592 нм), к сожалению, не подходит для 3D.

Подводя итог, мы выбрали STED как подход из-за его относительной простоты приложениеери и совершенствование в резолюции по стандартному изображений конфокальной. Для визуализации иммунную синапс, она доказала эффективную и ценную технику, которая позволяет нам подробности см. в F-актин архитектуры не представляется возможным при разрешении более 200 нм. В то время как многие из этих деталей, кажется тонким, они могут иметь огромное влияние на функцию NK-клеток. Таким образом, мы применяем новейшие технологии наноскопическая изображений для получения информации, что имеет решающее значение для поддержания здоровья человека.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Джефф Дэниелс для оказания технической помощи. Эта работа финансировалась R01 AI067946 в JSO

Materials

#1.5 cover slips VWR 48393-172
BD Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554722
Bovine serum albumin Sigma A2153
Cotton tipped applicator Fisher Scientific S450941
Falcon centrifuge tubes (50 ml) VWR 352070
Fetal calf serum (FCS) (500 mL) Atlantic Biologicals S11050
Goat anti-rabbit Pacific Orange Life Technologies P31584
Laboratory tissue wipers VWR 82003-820
Nail polish VWR 100491-940
NK-92 cells ATCC CRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488 Life Technologies A12379
Phosphate buffered saline Life Technologies 14190250
Prolong anti-fade reagent Life Technologies P7481
Purified anti-CD18 Biolegend 301202
Purified anti-NKp30 Biolegend 325202
Purified anti-perforin Biolegend 308102
RPMI 1640 medium (500 mL) Life Technologies 11875-093
Saponin from Quillaja bark Sigma S4521
Super PAP pen Life Technologies 008899
Triton X-100 Electron Microscopy Sciences 22142
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
Huygens deconvolution software SVI Contact company
Leica SP8 TCS STED microscope Leica Microsystems Contact company
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
  2. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  3. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  4. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  5. Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
  6. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
  7. Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
  8. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  9. Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
  10. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  11. Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  12. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
  13. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  14. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  15. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
  16. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  17. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  18. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  19. Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
  20. Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
  21. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  22. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  23. Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
  24. Tonnesen, J., Nagerl UV, . Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
  25. Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
  26. Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
  27. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  28. Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  29. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  30. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
  31. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  32. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  33. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski, ., Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. 204 (10), 2305-2320 (2007).
  34. Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Tags

Immunological SynapseNatural Killer CellsActin ReorganizationSuper-resolution ImagingStimulated Emission Depletion (STED) NanoscopyTime-gated STEDCytotoxic SynapseF-actin Architecture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy. J. Vis. Exp. (85), e51100, doi:10.3791/51100 (2014).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image