Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Opmerking: alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. 1. Bereiding van plantaardige materialen en Buffers Voor N. benthamiana Groeien de Agrobacterium tumefaciens stammen van belang zijn voor tijdelijke expressie (in dit voorbeeld Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG en lege vector als controle) door schudden (200 rpm) in vloeibare cultuur (L medium met geschikte antibiotica) bij 28 ° C tot stationaire fase. Verzamel pellet agrobacteriën door centrifugeren (3000 g gedurende 5 minuten). Gooi en resuspendeer gepilleerd agrobacteriën in infiltratie buffer. Meet de hoeveelheid agrobacteriën door het verkrijgen van de optische dichtheid (OD) waarde bij een absorptie van 600 nm (Abs 600 nm). Stel de OD van bacteriën 0,1-0,8. Infiltreren 4 weken oude N. benthamiana planten (22 ° C, 16 uur licht) met agrobacteriën door hand (met 1 ml naaldloze injectiespuit) of vacuüm (voeg 0,02% v / v oppervlakteactieve stof). Opmerking: Gebruik de eerste bijna-volledig uitgevouwen blad, en de twee onmiddellijk oudere bladeren voor de meest effectieve proteïne-expressie. Voor detectie van geübiquitineerde of geacetyleerd eiwitten infiltreren bladeren met 100 nM MG-132 of 100 ng / ml trichostatine A, respectievelijk op 1 en 2 dagen na de infiltratie. Oogst de geïnfiltreerde bladeren 2-5 dagen na de infiltratie en vries in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters in een -80 ° C vriezer. Opmerking: Bepaal het beste niveau van expressie van het eiwit van belang vooraf door bemonstering in een tijdsverloop van 5 dagen en detecteren eiwitniveaus door immunoblotting. Voor A. thaliana stabiele transgene lijnen Grow A. thaliana zaden in 6-well platen gesupplementeerd met 5 ml vloeibaar MS-medium (1% gew / vol sucrose) per putje. Zet 3-5 zaden (gesteriliseerd en gelaagde) van de transgene lijnvan belang of de getransformeerde controle lijn per putje. Schudden bij 200 rpm gedurende twee dagen alvorens de plaat een kweekkamer en laat gedurende 2 weken (22 ° C, 10 uur licht). Oogst monsters en vries in vloeibare stikstof. Opmerking: u kunt gebruiken als een controle een transgene lijn uiten van een niet verwant eiwit met hetzelfde label als het eiwit van belang. Buffers Bereid buffer A. De gas-buffer gedurende 1-2 uur (voor RLKs andere membraangebonden eiwitten en nucleaire eiwitten, voeg 1% v / v IGEPAL CA-630 53). Opmerking: U kunt blijven Buffer A bij 4 ° C voor onbepaalde tijd. U kunt gebruik maken van 1% v / v Triton plaats van IGEPAL CA-360. Bereid 80 ml koude buffer B minstens 1-2 uur voor extractie. Opmerking: De ideale verhouding weefsel versus extractiebuffer 1:4 (w / v). 2. Protein Extraction Net voor de extractie bereiden 80 ml koude buffer C. <br /> Opmerking: Voeg 10 uM MG-132 voor de detectie van ubiquitinated eiwitten. Maal 20 g N. benthamiana weefsel (ongeveer 15 bladeren) of A. thaliana zaailingen (2-4 g per 6-wells plaat) in vloeibare stikstof met behulp van een vijzel en stamper. Voeg 80 ml koud Buffer C aan de 20 g gemalen weefsel, meng goed, en ontdooien op ijs. Opmerking: Grind alle monsters op hetzelfde moment (eiwit van interesse en controle). Homogeniseer met 3 uitbarstingen van 10 seconden elk bij volle snelheid een weefselhomogenisator (voorgekoeld bij 4 ° C). Filtreer door een 22-25 urn weefsel en centrifugeer bij 30.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Opmerking: Als alternatief, homogeniseren met een frisse voorgekoeld mortier en een stamper. Voor het blokkeren en wasstappen van de affiniteitsmatrix, bereiden 20 ml buffer D. Blok 100 ml geschikte affiniteitsmatrix met 500 ml koude buffer D bevattende 1% BSA gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Opmerking: Voorkeur affinity matrices omvatten anti-FLAG M2 agarose, Streptavidin agarose, GFP-Trap_A en anti-HA agarose. Wash 3x met 1 ml koude buffer D. Verwijder supernatant van extract en filter door een 0,45 urn spuit filter in een nieuwe buis op ijs. Opmerking: Het extract kleur moet groen of geel zijn, als het monster bruin is geworden, weggooien en opnieuw beginnen. Neem een ​​monster van het ruwe extract immunoblot, voeg 5x SDS-PAGE laadbuffer, vortex en denatureren door koken monsters gedurende 10 minuten bij 80-100 ° C in een warmte-blok. 3. Eiwit Immunoprecipitatie Verdeel het eiwit extract in twee 50 ml buisjes en voeg 50 ul van de affiniteitsmatrix gesuspendeerd in buffer D aan elke buis. Incubeer met zachte rotatie gedurende 2 uur bij 4 ° C. Opmerking: Langere incubatie zijn niet gevonden om de opbrengst te verhogen. Bereid 600 ul (6x kraal volume affiniteitsmatrix) elutiebuffer door aanBuffer D (uiteindelijke concentraties): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG-peptide (voor anti-FLAG M2 agarose) of 10 mm D-biotine (voor Streptavidin agarose). Opmerking: De elutie wordt niet aanbevolen in het geval van GFP-Trap_A en anti-HA matrices, dus ga direct aan de kook in 1x SDS-PAGE laadbuffer, stap 3.11. Neerslag de affiniteitsmatrix door centrifugeren bij 4 ° C (5 min bij 1000 xg). Een aliquot van de ongebonden extract immunoblot, de rest van de bovenstaande vloeistof, waardoor ongeveer 500 pi in de bodem van de buis. Resuspendeer de slurry oplossing met een wide-bore tip. Breng de gemengde slurry oplossing van beide buizen naar een 1,5 ml buis. Opmerking: Van nu af aan, gebruik 1,5 ml lage eiwitbinding microfugebuizen. Pulse 3x 5 seconden met behulp van een tafelcentrifuge om de affiniteit matrix neerslaan en verwijder het supernatant. Was 3-5x met 1 ml koude buffer D. Tussen de wasbeurten neerslaan de affiniteit Matrix zoals eerder beschreven en gooi het supernatant. In de laatste wasbeurt verwijdert overtollige Buffer D met de naald van een injectiespuit. Opmerking: Een laatste wassing met Buffer D met 0,1% IGEPAL kan worden gebruikt om verder te reduceren specifieke binding. Elueren met 200 ul van de juiste elutie buffer (voor anti-FLAG M2 of Streptavidin agarose zie stap 3.2) 3x, 5 min elke keer met constant schudden. Verzamel de 3 eluaten in een enkele buis. Concentreer de eiwitten met 30 ui van absorptie hars. Vortex, laat staan ​​voor 5 min en neerslaan van de hars (2 min bij 10.000 xg). Verwijder het supernatant. Opmerking: Voor GFP-Trap_A en anti-HA agarose, slaat u de stappen 3.9 en 3.10. Voeg 50 ul van 1x SDS-PAGE laadbuffer aan de neergeslagen affiniteitmatrix of absorptie hars. Vortex en kook gedurende 10 minuten bij 80-100 ° C in een warmte-blok. Centrifugeer de gekookte affiniteitsmatrix of hars gedurende 2 min bij 10.000 x g. Aliquot 5 pi van de supernatant voor immunoblot en lopen met andere fracties op een ~ 10 cm lang SDS-PAGE gel (Figuur 2). Voor scheiding en identificatie van de gefosforyleerde eiwitten door massaspectrometrie, laadt de resterende 45 ui op een ~ 19-cm SDS-PAGE-gel als extra scheiding vereist (figuur 2). Opmerking: Een lege baan kunnen tussen alle monsters om verontreiniging van monsters te beperken. 4. Eiwitvertering Vlekken op de SDS-PAGE-gel met colloïdaal Coomassie Brilliant Blue (CCBB) vlek. Opmerking: Minimaliseer pakken van de gel om besmetting te verminderen met keratine. Zorg ervoor dat geen van de apparatuur of instrumenten zijn gebruikt voor immunoblotting of andere activiteiten die restverontreiniging eiwit zou hebben verlaten. Destain de gel met overvloedig wassen in water, bij voorkeur O / N. Snijd de band van belang uit de gel met een schone scheermesje. Opmerking: Breng de gel met de immunoblot als noodzakelijkerwijsry om de juiste plek te lokaliseren. Zoals fosforylering migratie van eiwitten kan vertragen op SDS-PAGE snijd het gebied direct boven en onder de band van belang. Snijd de gel sneetje in blokjes van 2-4 mm (dit zorgt ervoor dat de gel van oplossingen in de buis vallen zonder blokkering pipetpunten). Plaats in een buis. Schatten het volume dat nodig is om de gel goed onder water te houden. Gebruik dit bedrag voor derivatisering, incubatie met protease en peptide extractie, en dubbelklik vervolgens gebruiken om triple volumes voor het wassen. Opmerking: In een typische verteren met ongeveer 100 ul van de snede gel stukken, gebruik 500 ul oplossing voor het wassen, 2 x 180 ul voor uitdroging, 150 ul voor reductie, 120 ul voor alkylering en 120 ul voor de spijsvertering. Was de gelstukken 2 x 20 min (of totdat ontkleurd) door toevoeging van 50% acetonitril (in 50 mM ammoniumbicarbonaat, ABC). Pipetteer van de oplossing zorg gel stukken niet te verwijderen. Dehydrateren met 100% acetonitril gedurende 5 minuten en verwijder vrije vloeistof. Opmerking: De gel moet gekrompen en wit verschijnen. Wanneer de blauwe kleur blijft, langer incuberen in acetonitril / ABC en / of bij verhoogde temperatuur (45-55 ° C). Verminder eiwit disulfidebindingen door het toevoegen van 10 mM DTT in water en incubeer 30-45 minuten bij 56 º C met schudden. Verwijder vrije vloeistof. Alkylaat cysteïne residuen door de toevoeging van 55 mm chlooraceetamide (in 50 mM ABC) gedurende 20-30 min. (kamertemperatuur, donker). Verwijder vrije vloeistof. Was gelstukken 2 x 10 minuten met 50% acetonitril (in 50 mM ABC). Verwijder vrije vloeistof. Uitdrogen gel stukken met 100% acetonitril gedurende 5 minuten en verwijder vrije vloeistof. Voor de tryptic verteren, voeg 40 ul van trypsine werkoplossing (100 ng van trypsine in de spijsvertering buffer: 50 mM ABC, 5% acetonitril voor een gemiddelde Coomassie gekleurde band). Laat gel stukken te rehydrateren gedurende 10 minuten. Genoeg van de spijsvertering buffer toe te voegen aan gelstukken dekken indien nodig. Incubeer bij 37 º CO / N. Om de vertering stoppen en extraheer de peptiden uit de gelstukken, voeg 5% mierenzuur (in 50% acetonitril) (voeg hetzelfde volume als de vertering volume). Ultrasone trillingen gedurende 5-10 minuten. Breng de bovenstaande nieuwe buis. Herhaal de extractie 3x. Droog de peptiden door lyofilisatie (voorkeur) of een vacuümconcentrator (zoals Speed-Vac of Savant). Bewaren bij -20 º C. Dien uw steekproef voor massaspectrometrie. Opmerking: Wij legden onze steekproef aan de massaspectrometrie faciliteit in De Sainsbury Laboratory (Norwich, UK). Protocollen bij massaspectrometrie faciliteiten variëren aanzienlijk, maar meestal peptides worden opgelost in 0,2% trifluorazijnzuur met 2% acetonitril Voordat aan vloeistofchromatografie systeem gekoppeld aan electro-spuiten tandem massaspectrometrie.