זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח
Summary
אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.
Abstract
צמחים להסתגל במהירות לשינויים בסביבה בשל לפרט תפיסה ומערכות איתות. במהלך התקפת הפתוגן, צמחים במהירות להגיב לזיהום באמצעות הגיוס וההפעלה של מתחמים חיסוניים. הפעלה של מתחמים חיסוניים קשורה לאחר translational שינויים (PTMs) של חלבונים, כגון זרחון, glycosylation, או ubiquitination. ההבנה כיצד PTMs אלה כוריאוגרפיה תוביל להבנה טובה יותר של איך התנגדות מושגת.
כאן אנו מתארים שיטת טיהור חלבונים לחוזרים מחייב נוקלאוטיד לאוצין עשיר (NB-LRR)-אינטראקציה חלבונים וזיהוי הבא של שינוייהם שלאחר translational (PTMs). עם שינויים קטנים, הפרוטוקול יכול להיות מיושם לטיהור של קומפלקסי חלבונים צמחיים אחרים. השיטה מבוססת על הביטוי של גרסה מתויג epitope של החלבון של עניין, אשר לאחר מכן הוא מטוהר באופן חלקי בimmunoprecipitation y ונתון ספקטרומטריית מסה לצורך זיהוי של חלבונים וPTMs אינטראקציה.
פרוטוקול זה מוכיח כי: ט). שינויים דינמיים בPTMs כגון זרחון יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה; השני). זה חשוב לנו כמויות מספיקות של החלבון של עניין, וזה יכול לפצות על חוסר טוהר immunoprecipitate; iii). על מנת לזהות PTMs של חלבון של עניין, חלבון זה יש immunoprecipitated כדי לקבל כמות מספקת של חלבון.
Introduction
מסלולים חיסוניים להסתמך על שלאחר translational שינויים שונים (PTMs) של חלבונים לtransduce במהירות אותות ולהפעיל את תגובה חיסונית 1. PTMs הם שינויים כימיים מהירים, הפיכים, ומאוד ספציפיים של מבנה חלבון שיכול להשפיע על קונפורמציה בחלבון, פעילות, יציבות, לוקליזציה, ואינטראקציות בין חלבונים 2-4. בצמחים, יותר מ -300 סוגי PTMs זוהו כוללים ubiquitination, sumoylation, sulfation, glycosylation, וזירחון 2,5. גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש את החשיבות של PTMs בהיבטים שונים של חסינות צמח 1,5,6. זירחון חלבון, הקובץ המצורף הפיך של קבוצת פוספט לסרין, שאריות תראונין או טירוזין הוא רגולטור של פונקציות רבות תאיות, שאינו מפתיע למדו PTM גבוה ביותר בהגנת צמח איתות מפלים 5-11. איתות זירחון תלוי היא חלק בלתי נפרד מהמפעל defeהפעלת NSE יזם לאחר תפיסה תאית של חיידקים על ידי קולטנים הטרנסממברני, או הכרה תאית על ידי חלבוני התנגדות multidomain 5,8.
עם פלישה לצמחים, חיידקים זוהו על ידי קולטני קרום פלזמה נקרא קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) 12. PRRs ידוע הם או חלבונים כמו קולטן (RLPs) או קינאזות כמו קולטן (RLKs), שניהם נושאים ectodomain מחייב ליגנד ותחום הטרנסממברני אחת לעבור. בניגוד לRLPs, יש לי RLKs תחום קינאז תאיים 13-15. Ectodomain של PRRs נקשר למולקולות elicitor חיידק שימור נקראות הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן מוביל (PAMPs), במקרה של RLKs, לautophosphorylation וtransphosphorylation בתוך התחום תאיים 6, 16. במורד הזרם של זירחון-Induced תפיסת PRRs, זירחון הבא של חלבוני cytoplasmic כולל קינאזות 17, </sup> 18, E3 ligases 19, קינאז החלבון מופעל mitogen (MAPKs) 20, 21, קינאז חלבון סידן תלוי (CDPK) 22, 23, ושעתוק גורמי 24, 25 מוביל לחסינות מופעלת-PAMP (PTI).
בנוסף לתפיסה תאיים על ידי PRRs, הכרה תאית של פתוגנים מושגת באמצעות קולטנים cytoplasmic. חלבוני התנגדות multidomain אלה (R) מכילים תחום משתנה N-סופית, מוטיב מרכזי מחייב נוקלאוטיד (NB), וחוזר בטרמינל C-לאוצין עשיר (LRR) ונקראים לכן חלבוני NB-LRR 26, 27. חלבוני R במישרין או בעקיפין להכיר במולקולות המופקת ממחולל מחל ארסיות נקראות effectors, הידוע גם למקד PRRs וצומת אחרים של מערכת החיסון. הכרה גורמת לגינות חזקות שמובילות לחסינות-מופעל על מפעיל (ETI) 28-31. יש חלבוני NB-LRR requisite ATP מחייב מוטיב בתוך תחום NB 30, 32, אך הם חסרים תחום קינאז. זירחון של תחומים שימור של NB-LRRs כבר דיווח בסקר proteomic בקנה מידה גדולה 33, אבל הרלוונטיות שלה לETI אינן ברורה. בדומה לPTI, הפעלה של חלבוני NB-LRR מובילה לזירחון של חלבוני cytoplasmic כולל MAPKs 34-37 וCDPKs 38-40. והכי חשוב, הכרת מפעיל יכולה להוביל לזירחון של חלבוני אבזר המתקשרים ישירות עם חלבוני NB-LRR 41. כמה דוגמאות כוללות RIN4 (thaliana ארבידופסיס) וPto (עגבנייה, Solanum lycopersicum) חלבונים הפועלים באינטראקציה עם חלבוני NB-LRR, 42 RPM1, 43 ו44 PRF, בהתאמה. במהלך זיהום על ידי חיידקי Pseudomonas syringae, חלבון מפעיל AvrB גורם זירחון RIN4, ככל הנראה על ידי קינאז כמו קולטן RIPK 45, <sup> 46. באופן דומה, בעגבניות פ syringae effectors AvrPto וAvrPtoB לגרום זירחון של Pto 47. בניגוד לRIN4 שחסר תחום קינאז וחייב להיות טרנס פוספורילציה, PTO הוא קינאז פעיל מסוגל האוטומטי זירחון 48 וטרנס זירחון של מצעים 49, 50. בעוד Pto דורש פעילות קינאז לייזום מפעיל תלוי של איתות, מוטציות Pto קינאז מת עדיין מסוגלת לאותת בדרך מפעיל עצמאי 51. לאחרונה הסבירו את התצפיות הללו על ידי הוכחת כי מורכב PRF / Pto הוא oligomeric, המכיל PRF מרובה וPto מולקולות 52 וכי מולקולות Pto בתוך אותו מורכב יכולות טרנס phosphorylate אחד את השני 47. הצענו מודל שבו מולקולה אחת של Pto (חיישן) אינטראקציה עם חלבון מפעיל, וגרמה לשינוי קונפורמציה לחלבון NB-LRR (PRF) שבתורו מפעיל מולקולה שנייה Pto (עוזר) שנינותהין המורכב. בהמשך לכך, העוזר Pto טרנס phosphorylates מולקולת החיישן Pto מוביל להפעלה מלאה של ההתנגדות המורכבת 47.
דוגמאות אלו מראות כי זיהוי של רכיבים מורכבים חיסוניים וPTMs את הפוטנציאל שלהם בעת הכרת מפעיל יכול להוביל להבנה טובה יותר של כיצד אותות transduced מתפיסת מפעיל למטרות במורד הזרם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור חלבונים לחלבוני NB-LRR-אינטראקציה וההזדהות הבאה של PTMs. אנו משתמשים benthamiana ניקוטיאנה ומורכב עגבניות PRF / Pto כמודל, אבל באותו הפרוטוקול בקלות יכול להיות מיושם על RLKs מנ benthamiana וא ' thaliana 53 עם שינויים קטנים כפי שאנו מתארים במסגרת הפרוטוקול.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבהרת המנגנון של הפעלת קולט ידי PAMPs וeffectors יכולה לתרום רבה להבנה של חסינות מפעל שלנו. בשנים האחרונות 20, מסכי שני היברידיים גנטיים ושמרים כבר סייעו לגילוי PRRs והחלבונים NB-LRR. לאחרונה, פרוטוקולים מבוססי ספקטרומטריית מסה הוקמו לצורך זיהוי של חלבונים מווסתים באופן דיפרנציאלי במהלך חיסוניים מאותתים 55-58, PTMs 11,33,59,60, ההרכב של קומפלקסים חיסוניים 61 ומפעיל מטרות 62. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזיהוי PTMs המסדיר את ההפעלה של מתחמים חיסוניים.
בהשוואה לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מפורט של שינויים דינמיים של PTMs. פרוטוקולים של גישות פרוטאומיקה בקנה מידה גדולה יכולים לזהות PTMs של חלבונים אבל לא מסוגל לחשוף את פלסטיות האתר של PTMs בשל להגבילed הסכומים של חלבון. במקרה של זירחון חלבון, גישות פרוטאומיקה בקנה מידה גדולה בדרך כלל לזהות רק אתרי זירחון השולט 11,33,59. האפיון מפורט של מעמד זירחון החלבון דורש כמות משמעותית של חלבון שיכול להיות מושגת רק באמצעות טיהור חלקית של חלבון המטרה 47. הפרוטוקול מתואר כאן זוגות גישת טיהור חלבונים שמניבה כמות משמעותית של חלבון המטרה, עם ניתוח ספקטרומטריית מסה של החלבון מטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, אירוע זירחון היחיד של Pto יוחס בעיקר לSer-198 כפי שתואר קודם לכן 52 אבל כמה ספקטרום ספקטרומטריית מסה נתמך גם על אירוע זירחון יחיד על THR-195 או THR-199. כאשר אירועי זירחון כפולים של Pto נצפו, שילוב הדומיננטי של חומצות אמינו פוספורילציה היה Ser-198 וTHR-199 למרות שילובים באתרים אחרים נצפו גם (טבלה 1). תוצאות אלו מראות בבירור פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון והיכולת של הפרוטוקול המתואר לאפיין בפרטים כל אתרי זירחון האפשריים.
השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם: 1) מיצוי מספק של חלבונים, 2) הגנה על PTMs: 3) כמות מספקת של חלבון המטרה של. ראשית, למיצוי מספק של חלבונים, חשוב לטחון את הרקמות בחנקן נוזלי ולאחר מכן להשתמש homogenizer רקמות כפי שתואר בפרוטוקול. אם homogenizer רקמות אינו זמין, ניתן להשתמש במכתש ועלי. כמו כן, חשוב להשתמש ביחס של אחד לשלוש (או ארבעה) של גרמים של רקמה לנפח של מיצוי מאגר. רקמה זו למאגר יחס וחיץ החוזק הגבוה שאנו מציעים תבטיח כי את ה-pH תישאר ניטראלית במהלך תהליך החילוץ. מצאנו שזו היא בעלת חשיבות מיוחדת עבור א thaliana ועגבניות נוספותctions 52. הגנה של PTMs יכולה להיות מושגת על ידי כולל בכל מאגרי מעכבים המתאימים של אנזימים שיכולים להסיר PTMs. זה גם קריטי לבצע את כל צעדים על 4 מעלות צלזיוס וprechill מאגרים ומכשירים. תשואות גבוהות יותר חלבון המטרה של יכולות להיות מושגת על ידי שימוש בצמחים המבטאים את החלבון בכמויות מספיקות ועל ידי שימוש בכמויות גדולות של רקמה (כ 20 ז). הצעד החשוב ביותר להשגת כמות מספקת של חלבון המטרה של מתרכז חלבון המטרה על ידי immunoprecipitation הישירה. המשמעות של הצעד הזה מודגש על ידי כישלוננו לזהות PTMs של Pto לאחר immunoprecipitation PRF בשל הכמות המוגבלת של coimmunoprecipitated Pto (איור 2). לעומת זאת, immunoprecipitation הישירה של Pto הניבה פפטידים באופן משמעותי יותר למדידה (איור 2 ג) שמוביל לכיסוי כ 80% מרצף החלבון וזיהוי של PTMs (טבלת 1). אנחנו גם strongly ממליץ על שימוש בepitope תגים לimmunoprecipitation חלבון. בהשוואה לנוגדנים שהועלו נגד מטריצת זיקת epitope תגי חלבונים האם יכול להניב כמויות גדולות יותר של חלבון מטוהר באופן חלקי. באמצעות נוגדן שהועלה נגד חלבון ילידי Pto 51 (איור 2 א) לimmunoprecipitation, הצלחנו לזהות זירחון אחד בלבד של שני אתרי זירחון השולט של Pto.
פרוטוקול זה בעיקר פותחו לטיהור חלקית של נ ' benthamiana חלבון cytoplasmic וההזדהות הבאה של אתרי זירחון שלהם. עם זאת, באמצעות השינויים המתוארים במסמך, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לא חלבוני thaliana וחלבונים קרום מחויב. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להניב כמויות מספיקות של חלבון המטרה לזיהוי PTMs ולא כדי להשיג את הטוהר הגבוה ביותר של המתחם. אם טוהר גבוה יותרמנדרש המורכב ניתן להוסיף שלב שני של טיהור לפרוטוקול זה 52. במקרה זה, צעד ראשון יאפשר elution של חלבון המטרה ממטריצת הזיקה ללא השימוש במלחים או חומצה גבוהות והשלב הבא עלול להיות כרוך במטריקס, אשר דורש תנאי elution קשים. חשוב להדגיש שיש לנו רק נבדקו פרוטוקול זה לזיהוי אתרי זירחון ושאנו בודקים את יכולתה לזיהוי מפורט של PTMs נוסף כרגע.
תוצאות הנציג שלנו הראו בבירור את פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון והיכולת של הפרוטוקול המתואר לאפיין אתרי זרחון. והכי חשוב, הם מדגישים כי זיהוי של אתרי זירחון להסתמך בכמות נמוכה של חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה ועל ידי מוטציות נקודה אחת של אתרים האוטומטי זרחון יכול לתת תוצאות מבלבלות. אנחנו מראים כאן בעבר ו47 </sup> כי זירחון הכפול של Pto על Ser-198 וTHR-199 קשור להפעלה של מתחם PRF / Pto. לעומת זאת, תוצאות שפורסמו בעבר 47,63 הראו כי מוטציות נקודה אחת של Ser-198 וTHR-199 לאלאנין, המונעים זירחון באתרים אלו, מסוגלים איתות המצביעה על זירחון שהאתרים האלה הוא לא תנאי הכרחי להפעלה מורכבת . כעת ניתן להסביר תוצאות אלו על ידי זירחון של האתר המשני THR-195. ניתן להשיג תובנה דומה לפלסטיות אתר זירחון של חלבון קינאז השונה הבאה בפרוטוקול זה. יתר על כן, גישה משולבת בשימוש באתרי זירחון להצביע מוטציות, חלבונים שיכולים לעכב קינאז הספציפי (מפעיל) בשילוב עם immunoprecipitation חלבון וניתוח ספקטרומטריית מסה יוביל להבנה טובה יותר של המשמעות האבולוציונית של פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VN נתמך על ידי החברה המלכותית. JPR הוא עתיד עמית מועצה למחקר אוסטרלי (FT0992129). אנו מודים לד"ר מרים גיפורד לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
Referencias
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D’Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -. J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D’Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
