Vi har etablert et fluorescerende in situ hybridisering protokoll for påvisning av en vedvarende DNA-virus-genomet i vevssnitt fra dyremodeller. Denne protokollen muliggjør å studere infeksjonsprosessen etter codetection av det virale genomet, dets RNA-produkter, og virale eller cellulære proteiner i enkeltceller.
Enkel celle codetection av et gen, er dens RNA produkt og cellulære regulatoriske proteiner avgjørende å studere genekspresjon regulering. Dette er en utfordring innen virologi, spesielt for atomreproduserende vedvarende DNA virus som involverer dyremodeller for sin studie. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) etablerer en livslang latent infeksjon i perifere nerveceller. Latent virus fungerer som reservoar, hvorfra det reaktiverer og induserer en ny postherpetisk episode. Den cellebiologi av HSV-1 latens fremdeles dårlig forstått, delvis på grunn av mangel på fremgangsmåter for å påvise HSV-1 genomet in situ i dyremodeller. Vi beskriver en DNA-fluorescerende in situ hybridisering (FISH) tilnærming effektivt oppdage lav-kopi virale genomer innenfor deler av nevrale vev fra infiserte dyremodeller. Metoden baserer seg på varmebaserte antigen avslørt, og direkte merket hjemmelagde DNA-prober, eller kommersielt tilgjengelige sonder. Vi utviklet en trippel Staining tilnærming som kombinerer DNA-FISH med RNA-FISH og immunfluorescens, ved hjelp av peroksidase basert signalamplifikasjon å imøtekomme hver farging kravet. En stor forbedring er muligheten til å få tak i, i løpet av 10 mikrometer vevssnitt, lav-bakgrunnssignaler som kan avbildes med høy oppløsning ved konfokalmikroskopi og bredt felt konvensjonell epifluorescence. I tillegg er trippel farging arbeidet med et bredt spekter av antistoffer rettet mot cellulære og virale proteiner. Den fullstendige protokollen tar 2,5 dager for å få plass til antistoff og sonden gjennomtrengning i vevet.
Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) er en vedvarende human neurotropisk virus, å etablere en langtids latent infeksjon i neuroner fra trigeminal ganglia (TG) på det perifere nervesystemet, hvorfra det reaktiverer periodisk for å replikere og spres. HSV-1 genom er en 150 kb dsDNA lokalisering i kjernen av verten nervecellen hvor det fortsatt som multikopiplasmider chromatinized plasmider, som ikke integreres i vertscellen genom 1,2. Under ventetid blir HSV-1 replikasjonssyklus genetisk program sterkt undertrykt, og genekspresjon er begrenset til latens-assosiert transkripsjon (LAT) locus, fra latens etablering til initiering av reaktive 3.. LAT produserer en lang 8,5 kb kodende RNA behandlet i en stor 2 kb stabil lariat, og flere miRNA 4-7. HSV-1 latens er således kjennetegnet ved tilstedeværelse av det virale genom-DNA, LAT RNA og fravær av påvisbare replicative syklusproteiner.
ontent "> Dyremodeller, hovedsakelig mus og kanin, er eksperimentelle modeller rekapitulere flere funksjoner i ventetid i menneskelig. Et av de viktigste interessene til disse modellene er at de tillater å studere fysiologiske aspekter av HSV-1 ventetid hos immunkompetente verter. løpet av de siste tiårene , mange eksperimentelle verktøy, for eksempel genmodifiserte virus og mus, har blitt utviklet for å studere fysiologi, genetikk, og cellebiologi av HSV-1 ventetid, fra animalsk vev. Inntil nå, ble viral genomisk DNA påvist og kvantifisert ved Southern blot og qPCR fra dissosiert TGS. Imidlertid er det for tiden ingen metode tilgjengelig for å detektere HSV-1-genomet ved in situ hybridisering på vevssnitt 8. Følgelig latens rutinemessig vurdert på histologiske snitt gjennom påvisning av LAT RNA av RNA in situ hybridisering fremfor virale genom deteksjon. Fordi det har vært umulig å karakterisere infiserte celler basert på tilstedeværelsen av virale genomer, this teknisk begrensning har vært en stor ulempe for analyse av mange aspekter av den vert-virus vekselvirkninger, slik som forholdet mellom det virale genom og cellulær og viral genekspresjon, eller vertscelle-medierte immunrespons 9,10.Viktigst, celle-til-celle heterogenitet av latent infeksjon er fortsatt relativt uutforsket og har vist seg å være en viktig funksjon i ventetid hos mus og i menneskelige sensoriske ganglion nevroner implantert i SCID mus 11-17. Vanligvis ble det vist ved qPCR at HSV-1-genomet kopitall pr celle varierer fra 5 til flere hundre. Selv LAT vises som en viktig regulator av ventetid og reaktivering, qPCR data på isolerte nerveceller og i situ PCR viste at bare en undergruppe av latent infiserte nevroner, så lavt som 30%, uttrykker LAT locus 11,12,18-21. Slik vertscellen og den cellulære miljø i vevet virkning på viruset latens anleggetviral genuttrykk er fortsatt uklart. Her beskriver vi en robust fluorescerende in situ hybridisering (FISH) metode for effektiv påvisning av lav-kopi HSV-1 genomisk DNA innen dyre nevrale vev seksjoner. Denne metoden har vært utviklet og brukt av oss til å få tilgang til høy oppløsning mikros bildebehandling som er nødvendig for å studere samspillet av viral genom med vertscellen intra-kjernefysiske komponenter 22. I tillegg beskrives en flerfargemetoden for den samtidige påvisning av virus-DNA med RNA og proteiner, som er et unikt verktøy for å beskrive de virus-verts interaksjoner som regulerer viral genekspresjon. Fremgangsmåten kan også anvendes for en lang rekke analyser som krever påvisning av HSV-1-genomet latent, slik som kvantifisere infiserte nevroner i stort antall seksjoner. Et viktig trinn er å anvende antigen gjenfinning behandling for å gjøre det virale DNA tilgjengelig for hybridisering. Dermed kan denne protokollen også være effektivt å påvisningav andre dsDNA virus, som for øyeblikket ikke oppdages ved konvensjonelle DNA-FISH tilnærminger innenfor animalsk vev.
Den protokoll som er beskrevet her gjør det mulig for påvisning av HSV-1-genomet latent i nevroner i mus neuronal vevssnitt. Forståelsen av banene som regulerer viral genekspresjon har vært begrenset av den manglende metode for å detektere HSV-1 genomisk DNA in situ i neuronale vev. Informasjon om genomet kopi antall og andel av infiserte nevroner kom hovedsakelig fra PCR-analyse på dissosiert nevroner 11,12. I belyse rollen vertscellekjernearkitektur på HSV-1 latency, satt vi til å bestemme …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker N. Sawtell (Cincinnati Children Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, UK) og James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) for å gi eksempler fra HSV-1 -infiserte mus og kaniner, henholdsvis, og for reagenser, H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan) og S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Frankrike) for nyttige diskusjoner.
Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (ATIP program, til PL, http://www.cnrs.fr), den franske National Research Agency (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), den FINOVI Foundation ( http://www.finovi.org/:fr:start ), den LABEX DEVweCAN (ANR-10-LabX-61 ) av Université de Lyon, i programmet "Investissements d'Avenir "(ANR-11-IDEX-0007) drives av ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 og ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), og Inca (EPIPRO program, http://www.e -cancer.fr ). FC og PL er CNRS forskere.
Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217–225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50µL of 1N NaOH, and heat at 60°C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
1X PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS. |
Cryosectionning embedding medium – Tissue-Tek OCT Compound – | SAKURA | 4583 | |
Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20°C |
Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
0.5M EDTA | Sigma | E6758 | |
G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
Salmon sperm DNA 10mg/mL | Invitrogen / Life Technologies | 15632-011 | |
Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
Salmon sperm DNA | Invitrogen / Life Technologies | 15632-011 | |
Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
20X Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2X SSC solution in ddH20. |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4°C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use. |
10mM sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use. |
Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
Dextran sulfate – MW 500 000 | Euromedex | EU0606-A | |
Denhardt's solution (100X) | Euromedex | 1020-A | |
Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
DNA purification kit – Qiaquick PCR purification kit – | Qiagen | 28104 | |
T7 in vitro transcription kit | Ambion / Life Technologies | AM1314 | |
Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
RNA purification mini-column | Qiagen | 73404 | |
Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water |
Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
Primary antibodies | Any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen / Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001) | |
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen / Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen / Life Technologies | #T20932 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen / Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5µg/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution. |
22x50mm coverslip. n°1.5 glass. | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
Mounting medium with anti-fading agent – Vectashield – | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science |
Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
EQUIPMENT | |||
Equipment / material | Company | Reference | Note |
Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Home made. | ||
Dissection equipement | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
Micro-syringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
-80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80°C | |
Domestic microwave oven | |||
Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |