La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Tipo virus herpes simplex 1 (HSV-1) è un virus umano neurotropo persistente, stabilendo una infezione latente a lungo termine nei neuroni dei gangli del trigemino (TG) del sistema nervoso periferico, da cui si riattiva periodicamente per replicare e diffondersi. La HSV-1 è un genoma 150 kb dsDNA localizzazione nel nucleo del neurone ospitante dove rimane plasmidi chromatinized come multicopia, che non si integrano nel genoma della cellula ospite ^1,2. Durante la latenza, il programma genetico HSV-1 ciclo replicativo è fortemente represso, e l'espressione genica è limitata alla trascrizione latenza associata (LAT) locus, da stabilimento latenza apertura di riattivazione ^3. LAT produce un lungo 8.5 kb non codificante RNA trasformato in un importante 2 kb lariat stabile, e molti miRNA ^4-7. HSV-1 latenza è quindi caratterizzato dalla presenza del DNA genomico virale, LAT RNA, e l'assenza di proteine ​​del ciclo replicativi rilevabili.

ONTENUTO "> I modelli animali, prevalentemente topo e coniglio, sono modelli sperimentali riassumono diverse caratteristiche di latenza umana. Uno dei principali interessi di tali modelli è che essi consentono studiare aspetti fisiologici di HSV-1 latenza in ospiti immunocompetenti. Negli ultimi decenni , molti strumenti sperimentali, quali virus e topi geneticamente modificati, sono stati sviluppati per studiare la fisiologia, genetica e biologia cellulare di HSV-1 latenza, da tessuti animali. Finora, DNA genomico virale è stata rilevata e quantificata mediante Southern blot e qPCR da dissociato TG. Tuttavia, attualmente non esiste un metodo per rilevare il HSV-1 genoma mediante ibridazione in situ su sezioni di tessuto ^8. conseguenza, la latenza viene normalmente valutata su sezioni istologiche attraverso la rilevazione di RNA LAT da RNA ibridazione in situ anziché rilevazione del genoma virale. Poiché non è stato possibile caratterizzare cellule infette in base alla presenza di genomi virali, this limitazione tecnica è stato un grave inconveniente per l'analisi di molti aspetti delle interazioni ospite-virus, come il rapporto tra il genoma virale e l'espressione genica cellulare e virale o cellulo-mediata risposta immunitaria dell'ospite ^9,10.

Soprattutto, l'eterogeneità cellula-cellula dell'infezione latente rimane relativamente inesplorato e ha dimostrato di essere un elemento chiave della latenza nei topi e nei neuroni dei gangli sensoriali umani impiantati in topi SCID ^11-17. Tipicamente, è stato dimostrato da qPCR che il HSV-1 genoma numero di copie per cellula varia da 5 a diverse centinaia. Anche se LAT appare come un regolatore chiave della latenza e la riattivazione, i dati qPCR sui neuroni isolati e in situ PCR indicato che solo un sottoinsieme di neuroni latentemente infette, a partire da 30%, esprime il locus LAT ^11,12,18-21. Come la cellula ospite e l'ambiente cellulare all'interno del tessuto impatto sulla costituzione di latenza virus el'espressione genica virale rimane poco chiaro. Qui si descrive un robusto ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la rilevazione efficiente di bassa copia HSV-1 DNA genomico entro sezioni di tessuto neuronali animali. Questo metodo è stato progettato e da noi utilizzato per ottenere l'accesso a microscopia ad alta risoluzione di immagini che è necessario studiare l'interazione del genoma virale con la cellula ospite componenti intra-nucleari ^22. Inoltre, si descrive un metodo di colorazione multipla per la rilevazione simultanea del DNA virale con RNA e proteine, che è uno strumento unico per descrivere le interazioni virus-ospite che regolano l'espressione genica virale. Il metodo può essere applicato anche per una vasta gamma di analisi che richiedono la rilevazione di HSV-1 genoma latente, come quantificazione neuroni infetti in gran numero di sezioni. Un passo fondamentale è quello di applicare antigene trattamento di recupero per rendere il DNA virale accessibile a ibridazione. Così, questo protocollo potrebbe anche essere efficace per il rilevamentodi altri virus dsDNA, che attualmente non rilevabili da approcci DNA-FISH convenzionali all'interno di tessuti animali.