Påvisning af genom og Udskrifter af en Vedvarende DNA-virus i neuronvæv af Fluorescent In situ Hybridization Kombineret med Immunfarvning

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) er en vedvarende human neurotropisk virus, oprettelse af en langsigtet latent infektion i neuronerne i trigeminale ganglier (TG), i det perifere nervesystem, hvorfra det genaktiveres periodisk at replikere og sprede sig. HSV-1-genomet er et 150 kb dsDNA lokalisering i kernen af værten neuron, hvor den forbliver som multikopi chromatinized plasmider, som ikke integreret i værtscelle-genomet ^1,2. Under latenstid, er HSV-1-replikation cyklus genetisk program stærkt undertrykt, og genekspression er begrænset til latens-associerede udskrift (LAT) locus, fra latency etablering initiering af reaktivering ^3.. LAT producerer en lang 8,5 kb noncoding RNA forarbejdet til en større 2 kb stabil lasso, og flere miRNA ^4-7. HSV-1-latens er således kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​det virale genomiske DNA, LAT RNA og ved fravær af påviselige replikative cyklus proteiner.

NDHOLDET "> Dyremodeller, overvejende mus og kanin, er eksperimentelle modeller opridset flere funktioner af latens i menneskelig. En af de vigtigste interesser på disse modeller er, at de tillader at studere fysiologiske aspekter af HSV-1 latens i immunkompetente værter. Gennem de seneste årtier mange eksperimentelle værktøjer, såsom genetisk modificerede vira og mus, er blevet udviklet til at studere fysiologi, genetik og cellebiologi af HSV-1 latency fra dyrevæv. Indtil nu viralt genomisk DNA påvises og kvantificeres ved Southern blot og qPCR fra dissocieret TG'er. Der er imidlertid ingen metode til at detektere HSV-1-genomet ved in situ hybridisering på vævssnit ^8. Følgelig latenstid rutinemæssigt vurderes på histologiske snit gennem påvisning af LAT RNA ved RNA in situ hybridisering snarere end virale genom detektion. Fordi det har været umuligt at karakterisere inficerede celler baseret på tilstedeværelsen af ​​virale genomer, This tekniske begrænsninger har været en stor ulempe ved analyse af mange aspekter af vært-virus-interaktioner, såsom forholdet mellem det virale genom og cellulære og viral genekspression eller immunrespons ^9,10 værtscelle-medieret.

Vigtigst er det, at celle-til-celle heterogenitet af latent infektion er fortsat relativt uudforsket og har vist sig at være et centralt element i latens i mus og i humane sensoriske ganglion neuroner implanteret i SCID mus ^11-17. Typisk blev det vist af qPCR, at HSV-1-genomet kopiantal per celle varierer fra 5 til flere hundrede. Selv LAT vises som en vigtig regulator af latens og reaktivering qPCR data vedrørende isolerede neuroner og i situ-PCR viste, at kun en delmængde af latent inficerede neuroner, så lavt som 30%, udtrykker LAT locus ^11,12,18-21. Hvor værtscellen og cellulære miljø i vævet indvirkning på virus latency etablering ogviral genekspression stadig uklar. Her beskriver vi en robust fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) fremgangsmåde til effektiv påvisning af lav-kopi HSV-1-genomisk DNA i animalske neuronale vævssnit. Denne metode er blevet udviklet og bruges af os til at få adgang til høj opløsning mikroskopi billeddannelse, der er nødvendig for at studere interaktion mellem det virale genom med værtscellesystemerne intra-nukleare komponenter ^22. Derudover beskriver vi en multipel farvning fremgangsmåde til samtidig påvisning af det virale DNA med RNA og proteiner, som er et unikt værktøj til at beskrive virus-værts-interaktioner, der regulerer viral genekspression. Metoden kan også anvendes til en bred vifte af analyser, der kræver påvisning af HSV-1 latent genom, såsom kvantificere inficerede neuroner i mange sektioner. Et vigtigt skridt er at anvende antigengenfinding behandling for at det virale DNA tilgængelige til hybridisering. Således kan protokollen også være effektiv til påvisningandre dsDNA virus, som i øjeblikket ikke kan påvises ved konventionelle DNA-FISH fremgangsmåder i dyrevæv.