Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d'Intact poisson zèbre adulte
Summary
Ce document décrit comment un poisson zèbre adulte peut être immobilisé, intubé, et utilisé pour des expériences électrophysiologiques in vivo pour permettre des enregistrements et de la manipulation de l'activité neuronale chez un animal intact.
Abstract
Auparavant, les études électrophysiologiques chez le poisson zèbre adulte ont été limitées à trancher préparations ou de préparations de la Coupe des yeux et des enregistrements electrorentinogram. Ce document décrit comment un poisson zèbre adulte peut être immobilisé, intubé, et utilisé pour des expériences électrophysiologiques in vivo, permettant l'enregistrement de l'activité neuronale. Immobilisation de l'adulte nécessite un mécanisme pour fournir de l'oxygène dissous, les branchies à la place du mouvement buccale et operculaire. Avec notre technique, les animaux sont immobilisés et perfusés avec de l'eau de l'habitat à satisfaire à cette exigence. Une crâniotomie est effectuée sous méthanesulfonate de tricaïne (MS-222; tricaïne) anesthésie pour fournir l'accès au cerveau. L'électrode primaire est ensuite positionné à l'intérieur de la fenêtre de la craniotomie pour enregistrer l'activité cérébrale extracellulaire. Grâce à l'utilisation d'un système de perfusion multitubulaire, une variété de composés pharmacologiques peut être administrée à des poissons adultes et des modifications dans l'activité neuronalepeut être observée. La méthodologie permet non seulement d'observations à faire concernant les changements dans l'activité neurologique, mais il permet également d'effectuer des comparaisons entre les larves de poisson zèbre et des adultes. Ceci donne aux chercheurs la capacité à identifier des altérations de l'activité neurologique due à l'introduction de divers composés à différents stades de la vie.
Introduction
Dans cet article, un protocole est décrit pour l'obtention des enregistrements in vivo de l'activité neuronale chez le poisson zèbre adulte. Méthodes d'enregistrement extracellulaires sont utilisées, fournissant des mesures de tension de l'activité électrique à l'intérieur d'une petite région de tissu neural. Cette méthode d'investigation implique le suivi d'un grand nombre de cellules chez un animal à se comporter 1. Auparavant, les enregistrements de tranches ont été réalisées dans les deux adultes et les larves, comme l'ont fait les préparatifs de la Coupe des yeux et des enregistrements électrorétinogramme. Ces expériences ont été en grande partie réalisée au détail des réponses physiologiques des différents systèmes sensoriels 2-5. Jusqu'à récemment, les préparatifs du cerveau intactes ne sont disponibles pour effectuer l'électrophysiologie avec le poisson zèbre 3,6,7 larve, où la respiration et la diffusion d'oxygène peut se produire à travers la peau. Notre préparation permet l'activité neurologique native d'un poisson zèbre adulte à mesurer alors que l'animal reste pleinement conscient et of ses environs.
Poisson zèbre (Danio rerio) jouent actuellement un rôle fondamental en tant que modèle pour les études génétiques, toxicologiques, pharmacologiques et physiopathologiques 3. Poisson zèbre ont gagné en visibilité dans le domaine des neurosciences, car ils partagent une homologie avec des mammifères aux génétique, neuronaux et endocriniens niveaux 8. Au cours de la dernière décennie, les techniques neuroanatomiques et immunohistochimiques standard ont été utilisées pour déterminer l'organisation caractéristique détaillée du système nerveux poisson zèbre 9-12 et de la distribution des différents neurotransmetteurs 3,8,13. Plus récemment, les chercheurs ont déplacé leur attention à des études fonctionnelles 14,15, dont beaucoup centrées sur les processus comportementaux 16-19 et les caractéristiques électrophysiologiques des systèmes sensoriels 2,13,20. Un petit nombre de ces études se sont concentrées sur l'activité électrique des zones spécifiques de l'adult cerveau du poisson zèbre 21-23, mais n'ont pas été effectuées en utilisant une approche in vivo.
Ce protocole peut être adapté pour les études électrophysiologiques à la fois de l'activité spontanée et provoquée dans le système nerveux du poisson zèbre pour décrire les modèles de l'activité dans des régions cérébrales spécifiques. L'utilisation de cette technique permet d'effectuer des comparaisons entre l'activité neurologique des jeunes stades larvaires et les adultes. En outre, notre protocole permet des comparaisons entre les altérations génétiques ou pharmacologiques. Ensemble avec d'autres approches, telles que le génie génétique ou les tests pharmacologiques, cette méthode offre une nouvelle possibilité pour l'analyse fonctionnelle de la communication neuronale et la plasticité dans l'animal adulte intact ainsi que pour des applications potentielles, telles que l'étude de l'épilepsie de l'arrivée tardive ou processus neurodégénératifs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole a été utilisé pour mesurer l'activité neuronale de poisson zèbre adulte in vivo. Avec la pratique, l'activité neuronale peut être observée régulièrement, bien que les caractéristiques (amplitude et la forme des événements) de l'activité enregistrée peuvent varier entre individus. L'utilisation de la technique d'enregistrement extracellulaire peut expliquer cette observation. Le procédé permet la surveillance simultanée d'un grand nombre de cellules au sein …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH / NINDS Grant R01NS070159 (à la DGT, JDL et ATS).
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
Referencias
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