皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で
Summary
動的な縦イメージングレポータートランスジェニックマウスにおける神経終末の選択的レーザ病変のためのプロトコルが提供される。
Abstract
皮膚の神経終末、例えば神経因性疼痛2のような1を感知するように、ならびに病理学的過程における生理学的プロセスに関与している。彼らの近くに対地位置決めが無傷動物の生体における皮膚の神経終末の顕微鏡イメージングを容易にします。多光子顕微鏡を使用して、皮膚組織の強い光散乱の問題を克服精細な画像を得ることができる。 （末梢感覚ニューロンを含む）ニューロンでのThy-1プロモーターの制御下にEYFPを発現するレポータートランスジェニックマウスは、数ヶ月、あるいは生涯までの長期間にわたって個別の神経終末の縦断研究に適しています。さらに、イメージングと同じフェムト秒レーザーを用い、それは神経線維の再構築の研究のために神経線維の高度に選択的な病変を生成することが可能である。ここでは、in vivoイメージング縦多するための簡単で信頼性の高いプロトコルを提示しマウス皮膚の神経終末上のレーザーベースのマイクロサージェリー。
Introduction
皮膚の神経終末は、異なる病態生理学的状態の下での動的な変化を受ける。神経線維は末梢神経障害2またはモートン神経腫3のような疾患の過程で変性および再生や再編のプロセスを経ることができます。外傷後に、皮膚の神経終末ダイナミクスの重要な部分は、損傷を受けた領域の再神経支配である。しかし、神経終末の調査のための一般的なアプローチは、進行中の処理4に関するリアルタイム情報を欠いてex vivoでの組織学的の切片である。遺伝的にコードされた蛍光マーカーを用いて、このように構造変化リッチと有意に関連する情報を取得し、生きている動物の皮膚における神経終末を追跡することが可能である。皮膚の神経終末の調査は、従来の蛍光顕微鏡法を使用して可能であるが、皮膚組織の強い光散乱が強く品質を損なうデータの5を取得した。多光子顕微鏡は、対物レンズの焦点位置からの蛍光の発光をもたらす励起光の光子のエネルギーの非線形和に起因する強散乱組織において高解像度画像の取得を可能にする。この効果は、皮膚組織6の測定のためのロバストな侵入深さの増加および信号対雑音比の向上につながる。イメージングの場合と同じレーザを用いて、神経線維7の選択的な切開を作製することが可能である。以下のプロトコールでは、市販の多光子顕微鏡システムを用いて選択的レーザー病変と組み合わさレポータートランスジェニックマウスにおけるin vivoでの皮膚神経終末の長手方向のイメージングの方法を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
このビデオプロトコルでは、単一の神経終末の非侵襲的な縦二光子イメージングのための方法を実証する。
皮膚神経支配の力学は、乾癬及び末梢神経障害2、のような疾患および外傷9に影響されます。二光子イメージングは、コラーゲンマトリックス中の神経線維構造の詳細な分析を可能にする。トランスジェニックレポーターマウスの使用は、神?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、財政支援のための技術支援のためのNeurotar株式会社CIMO財団とFGSNに感謝したいと思います。
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
Referencias
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
