In Vivo to-foton mikroskopi af Single nerveender i hud
Summary
Protokollen til dynamisk langsgående billeddannelse og selektiv laser læsion af nerveender i reporter transgene mus præsenteres.
Abstract
Nerveender i huden er involveret i fysiologiske processer, såsom sensing 1, samt i patologiske processer såsom neuropatisk smerte 2. Deres tæt på overfladen positionering letter mikroskopisk billeddannelse af hudens nerveender i levende intakt dyr. Brug multifoton mikroskopi, er det muligt at opnå fine billeder overvinde problemet med stærk lysspredning af hudvævet. Reporter transgene mus, der udtrykker EYFP under kontrol af Thy-1-promotoren i neuroner (herunder periferien sensoriske neuroner) er velegnede til de langsgående undersøgelser af individuelle nerveender over længere perioder på op til flere måneder eller endda livslang. Desuden, ved hjælp af den samme femtosecond laser som til billeddannelse, er det muligt at fremstille yderst selektive læsioner af nervefibre for undersøgelser af omstrukturering nervefibrene. Her præsenterer vi en enkel og pålidelig protokol for langsgående multiphoton in vivo billeddannelse oglaserbaseret mikrokirurgi på musen hud nerveender.
Introduction
Kutane nerveender gennemgår dynamiske forandringer under forskellige patofysiologiske tilstande. Nervefibre kan gå gennem processen med degeneration og regeneration eller omstrukturering i løbet af sådanne sygdomme som perifer neuropati 2 eller Mortons neuroma 3. Efter traumatisk skade, en vigtig del af nerveender dynamik i huden er reinnervation af det beskadigede område. Men den fælles tilgang til undersøgelse af nerveender er ex vivo histologiske sektionering, der mangler oplysninger i realtid om de igangværende processer 4. Brug genetisk indkodede fluorescerende markører, er det muligt at spore de nerveender i huden på levende dyr, og dermed opnå rig og betydeligt mere relevante oplysninger om de strukturelle ændringer. Undersøgelsen af kutane nerveender er muligt under anvendelse af konventionel fluorescensmikroskopi imidlertid stærk lysspredning af hudvævet kraftigt underminerer kvalitetenaf de data, der er erhvervet 5. Multiphoton mikroskopi tillader erhvervelse af billeder i høj opløsning i stærkt spredende væv på grund af den ikke-lineære opsummering af energi excitationslyset fotoner resulterer i emission af fluorescens kun fra brændpunktet af målet. Denne effekt fører til en solid stigning i indtrængningsdybden og forbedring af signal-støj-forholdet for måling i hudvævet 6. Anvendelse af den samme laser som til billeddannelse, er det muligt at fremstille selektiv dissektion af nervefibre 7. I den følgende protokol viser vi metode langsgående afbildning af kutane nerveender i vivo i reporter transgene mus kombineret med selektiv laser læsion under anvendelse af kommercielt tilgængelige multifoton mikroskopsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne video protokol vi demonstrere fremgangsmåden til ikke-invasiv langsgående to-foton-billeddannelse af enkelt nerveender.
Dynamikken i huden innervationer påvirkes ved sådanne sygdomme som psoriasis og perifer neuropati 2, og i traumatiske skader 9. To-foton billedbehandling giver mulighed for en detaljeret analyse af nervefibre strukturer i collagen matrix. Anvendelsen af transgene reporter mus hjælper med at undgå de problemer vedrørende farvning af…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Neurotar Ltd for teknisk bistand, CIMO Foundation og FGSN for finansiel støtte.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
Referencias
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
