VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления
Summary
Вирус индуцированного глушителей гена является полезным инструментом для идентификации генов, участвующих в нехозяев устойчивости растений. Мы продемонстрировать использование бактериальных патогенов выразив GFPuv в определении генов замолчать растения восприимчивы к нехозяев патогенов. Такой подход легко, быстро и облегчает скрининг большого масштаба и аналогичный протокол может быть применен к изучению различных других растительно-микробных взаимодействий.
Abstract
Нехозяев устойчивость к болезням растений от бактериальных патогенов контролируется сложные пути защиты. Понимание этого механизма имеет важное значение для разработки прочных устойчивых к болезням растений от широкого спектра возбудителей. Вирус индуцированного глушителей гена (VIGS) на основе вперед генетика скрининга является полезным подходом для идентификации защиты растений гены придания нехозяев сопротивления. Вирусу табачной трещотка (ТЗМ) вектора на основе VIGS является наиболее эффективным VIGS вектор, дата и была эффективно использована чтобы заставить замолчать эндогенных генов-мишеней в Nicotiana benthamiana.
В этой рукописи мы демонстрируем вперед скрининга генетики подходом для замалчивания отдельных клонов из библиотеки кДНК в N. benthamiana и оценки реакции генов растений для замолчать под угрозой нехозяев сопротивление нехозяев патогенов, Pseudomonas syringae ру. томатным T1, П. syringae ру. GlycИНЕА, и X. сатрезЫз PV. vesicatoria. Эти бактериальные патогены спроектированы так, чтобы белок экспресс GFPuv и их зеленые флуоресцирующие колонии можно увидеть невооруженным глазом при УФ-света в нехозяев патоген инокулированных растений, если молчать целевой ген участвует в передаче нехозяев сопротивления. Это облегчает надежное и быстрое определение гена замолчать растения восприимчивы к нехозяев патогенов. Кроме того, перспективным информации ген-кандидат может быть известна последовательность вставки генов растений в ТРВ вектор. Здесь мы показываем, высокая пропускная способность VIGS-опосредованной вперед генетики идентифицировать гены, участвующие в нехозяев сопротивления. Примерно, 100 кДНК может быть индивидуально замолчать примерно в две-три недели и их актуальность в нехозяев сопротивления против нескольких нехозяев бактериальных патогенов могут быть изучены через неделю после этого. В этой рукописи мы перечисляем подробные этапы этого скрининга. VIGS-опосредованной вперед генетики Screeniнг подход можно распространить не только на выявление генов, участвующих в нехозяев сопротивления, но и к изучению генов придания нескольких биотических и абиотических допусков по ударным нагрузкам в различных видов растений.
Introduction
Нехозяев сопротивление сопротивление всех видов растений против расы конкретного патогена 1,2. Это придает широкий спектр и прочный устойчивость к болезням в растениях 2,3. Тем не менее, его механизм, особенно в отношении патогенных бактерий, не очень хорошо понял 4. Скрининг на мутантов или молчать растений, которые компромисс нехозяев сопротивление и высокий профилирования транскрипт пропускную способность для идентификации дифференциально экспрессированных генов во время нехозяев сопротивление 5-9 два основных подхода ранее использовались для рассечения бактериальной устойчивости нехозяев. Потому нехозяев сопротивления контролируется сложный механизм (ы) 4 с участием многих генов, высокая пропускная способность функционального подхода для геномной идентификации генов имеет решающее значение для лучшего понимания механизма сопротивления нехозяев (ы).
Вирус-индуцированные генов (VIGS) успешно используется, чтобы заставить замолчать эндогенных заводагенов во многих видах растений 10,11. Nicotiana benthamiana является одним из наиболее подходящих растений для VIGS 10,12 и проект генома теперь доступен 13. рэтл вирус (ТЗМ) на основе VIGS широко используется в качестве обратной генетики инструмент Для характеристики генов, участвующих в нехозяев сопротивления 2,4,14. Это VIGS векторов и производные теперь доступны через Arabidopsis Биологические ресурсный центр (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS была также использована в качестве инструмента вперед генетики для идентификации генов, участвующих в иммунитете растений 15-17, особенно нехозяев сопротивление 6,18. Оценка реакции гиперчувствительности (HR)-опосредованная гибель клеток индуцированные растений от специфических патогенов нехозяев и оценки вызванный болезнью гибели клеток два основных анализов в основном используется для identifyinг восприимчивы замолчать ген растений. Тем не менее, HR гибель клеток индуцируется только против второго рода патогенов нехозяев а не против Тип-I нехозяев патогенов 2. Следовательно, HR анализов не универсален и может применяться для выявления нехозяев стратегии сопротивления используется растениями, особенно в отношении широкого спектра типов патогенов Я нехозяев. Кроме того, частичную потерю нехозяев сопротивление в гене молчать растение не всегда приводит к симптомов заболевания 6 и, следовательно, болезнь скоринг не может быть использована для идентификации растений нехозяев снижения сопротивления. Наоборот, оценки роста нехозяев патогенов в геном растения замолчать является лучшим методом изучения потери нехозяев сопротивления в геном растения замолчать.
По сравнению с обычным анализом роста 6,19, более быстрый метод оценки нехозяев бактериального роста на гене молчать растений можно сократить время, необходимое для скрининга вперед генетики. Мы ранее сообщалось метод наблюдения бактерийл рост патогена на листьях невооруженным глазом под действием ультрафиолетового (УФ) света с помощью бактерий, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) 19. В этой рукописи мы продемонстрировать полезность GFPuv выразив нехозяев бактериальных патогенов для легкой идентификации гена замолчать растения, которые оказываются под угрозой для нехозяев сопротивления. Эта методика является точной идентификации восприимчивых растений и поддаются для высокопроизводительного скрининга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Иммунитет растений ограничивает рост нехозяев патогенов и, следовательно, мало или вообще не зеленая флуоресценция не выпустили из векторного управления установкой оставляет засевают нехозяев патогена под ультрафиолетовым светом длиной волны (рис. 3D). Однако, когда ген, учас…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался Сэмюэл Робертс Благородный Foundation. Авторы благодарят MS. Джени Gallaway и Коллин Elles за отличную Уход за растениями и г-жа Кэти Браун за произведения искусства. Мы также хотели бы поблагодарить MS. Trina Коттреллом, Пуджа Uppalapati, Moumita Саха, Swetha Vinukonda и г-н Исаак Greenhut за техническую помощь при создании этого протокола.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 96-well U-bottom plates | Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA) | 35-3077 | |
| 96-pin replicator stainless steel | Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA) | 250520 | |
| High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap | Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA) | 6283K50 | Manufacturer ID 95-0127-01 |
| Stuart SC6 colony counter | Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK | SC6PLUS | |
| Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350 | SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA) | ||
| Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) |
Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA) | Custom synthesized | |
| MES, Monohydrate | VWR international (Radnor, PA, USA) | CAS No. 145224-94-8 | |
| Acetosyringone (Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D134406 | |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) | Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA) | VIS-30 |
Referencias
- Heath, M. C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Currrent Opinion in Plant Biology. 3, 315-319 (2000).
- Mysore, K. S., Ryu, C. -. M. Nonhost resistance: how much do we know. Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).
- Ellis, J. Insights into nonhost disease resistance: can they assist disease control in agriculture. The Plant Cell. 18, 523-528 (2006).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Nonhost resistance against bacterial pathogens: retrospects and prospects. Annual Review of Phytopathology. 51, (2013).
- Lu, M., Tang, X., Zhou, J. -. M. Arabidopsis NHO1 is required for general resistance against Pseudomonas bacteria. The Plant Cell. 13, 437-447 (2001).
- Rojas, C. M., et al. Glycolate oxidase plays a major role during nonhost resistance responses by modulating reactive oxygen species mediated signal transduction pathways. The Plant Cell. 24, 336-352 (2012).
- Daurelio, L. D., et al. Transcriptome analysis reveals novel genes involved in nonhost response to bacterial infection in tobacco. Journal of Plant Physiology. 168, 382-391 (2011).
- Moreau, M., et al. EDS1 contributes to nonhost resistance of Arabidopsis thaliana against Erwinia amylovora. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 421-430 (2012).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Ornithine-delta-aminotransferase and proline dehydrogenase genes play a role in non-host disease resistance by regulating pyrroline-5-carboxylate metabolism-induced hypersensitive response. Plant, Cell & Environment. 35, 1329-1343 (2012).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. The Plant Journal. 39, 734-746 (2004).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. New dimensions for VIGS in plant functional genomics. Trends in Plant Science. 16, 656-665 (2011).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato. Plant Biotechnology Journal. 9, 797-806 (2011).
- Bombarely, A., et al. A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 1523-1530 (2012).
- Sharma, P. C., et al. Virus-induced silencing of WIPK and SIPK genes reduces resistance to a bacterial pathogen, but has no effect on the INF1-induced hypersensitive response (HR) in Nicotiana benthamiana. Mol Gen Genomics. 269, 583-591 (2003).
- Baulcombe, D. C. Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Current Opinion in Plant Biology. 2, 109-113 (1999).
- Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO Journal. 22, 5690-5699 (2003).
- Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKK[alpha] is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO Journal. 23, 3072-3082 (2004).
- Wang, K., Senthil-Kumar, M., Ryu, C. -. M., Kang, L., Mysore, K. S. Phytosterols play a key role in plant innate immunity against bacterial pathogens by regulating nutrient efflux into the apoplast. Plant Physiology. 158, 1789-1802 (2012).
- Wang, K., Kang, L., Anand, A., Lazarovits, G., Mysore, K. S. Monitoring in planta bacterial infection at both cellular and whole-plant levels using the green fluorescent protein variant GFPuv. New Phytologist. 174, 212-223 (2007).
- Ratcliff, F., Martin-Hernandez, A. M., Baulcombe, D. C. Technical Advance: Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. The Plant Journal. 25, 237-245 (2001).
- MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. Journal of General Virology. 80, 2799-2807 (1999).
- Anand, A., et al. Identification and characterization of plant genes involved in Agrobacterium-mediated plant transformation by virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 41-52 (2007).
- Liu, E., Page, J. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant Methods. 4, 5 (2008).
- Velásquez, A. C., Chakravarthy, S., Martin, G. B. Virus-induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and tomato. J. Vis. Exp. (28), e1292 (2009).
- Peart, J. R., et al. Ubiquitin ligase-associated protein SGT1 is required for host and nonhost disease resistance in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99. , 99-10869 (2002).
- Oh, S. -. K., et al. Insight into Types I and II nonhost resistance using expression patterns of defense-related genes in tobacco. Planta. 223, 1101-1107 (2006).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K., Kodama, H., Komamine, A. RNAi and Plant Gene Function Analysis. Methods in Molecular Biology. 744, 13-25 (2011).
