神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ<em>インビトロ</em

この手順では、英国内務省の規制（動物科学手続法、1986）に準拠しています。科学者たちは、彼らの機関や国の動物規制機関によって確立され、承認されたガイドラインに従う必要があります。 1。切開およびラットのRMS神経芽細胞の解離実効解剖、解離のために必要なソリューションを準備します。 解剖培地 （100ml）でハンクス平衡塩溶液（HBSS） – 98.5ミリリットル 5男のHEPES 7.4〜0.5ミリリットルペニシリン – ストレプトマイシン（10,000単位/ ml 10,000μg/ ml）を – 1ミリリットル 解離培地（2ml）に HBSS – 1.760ミリリットル 10倍のトリプシン（2.5％） – 200μL DNAse1（1 mg / ml）を – 40μL ダルベッコのイーグル培地（DMEM）+10％ウシ胎児血清（FCS）（40ml）に変形 DMEM中 -36ミリリットル FCS – 4ミリリットル 完全培地 （12ミリリットル） 神経基礎培地 – 11.46ミリリットル B27サプリメント – 250μL L-グルタミン（200 mM）の – 125μL グルコース（45％） – 165μlの 2。 DMEM + 10％FCS完全培地をフィルタリングし、滅菌し、37℃/ 5％CO 2インキュベーター内でそれらをpreequilibrate。 解剖頚椎脱臼により、P6-P7ラットのトイレ（約12匹）を犠牲にしてはさみで首を切る。 メスの刃と小脳に鼻から半ば矢状縫合に沿って皮膚内の前後の切開を加えます。皮をはがし頭蓋骨に沿って同じ切開を繰り返します。 優しく鉗子で頭蓋フラップを取り外し、慎重に嗅球を含めるように注意しながら、へらで脳を削除します。 脳の大部分の尾三分の一をカットして捨てる。 目のチョップ組織チョッパーを用いて厚さ1.4mm冠状スライスに電子脳組織。 冷たい解剖培地を含む皿の中でスライスを置き、慎重に針を使用して区切ります。 RMSは、OB部分の中央にある三角形、半透明領域として、より尾側脳スライス内の小さな円形の領域として表示されます。周囲の組織を含めないように注意しながら、顕微ナイフで各スライスのうちRMSをカット。 P7の仔ラットでは、通常、（OB含む）〜8最も頭側のスライスは、RMSが含まれています。 プラスチック製パスツールピペットで、RMS断片を収集し、氷上で冷たい解剖培地を含む小皿に配置します。 切開が完了したら、プラスチックピペットにて15mlチューブにRMSフラグメントを転送する。チューブの底に沈降する断片のままにしておきます。 解離解離培地2mlで解剖培地を交換してください。 優しくpで、RMS断片を粉砕するフラグメント·サスペンションアップipetting約10倍P1000ピペットを使用してダウン。 2分間37℃の水浴中で組織片をチューブのままにしておきます。 10倍再びソリューションをピペット断片は（懸濁液は白濁します）解離していることを確認してください。 予め温めておいたDMEM + 10％FCSを5mlを添加することによりトリプシンを不活性化する。 5分間433×gで細胞懸濁液を遠心分離する。 エッペンドルフチュー​​ブにそれまでの一定分量のsiRNA / DNAの必要量（通常3〜5μgのDNAを/ shRNAのか、ヌクレオあたり5-9μgのsiRNAオリゴは、しかし、DNA / siRNAの量が最適化が必要な場合があります）。 余分な培地を除去し、あらかじめ温めておいたDMEM +10％FCSを5mlに穏やかなピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。 細胞数を実行します。ラットの仔の脳あたり〜1×10 6の細胞を期待しています。ながら、2.5×10 6個の細胞の最小は、各クレオのために必要とされる最適な結果はヌクレオにつき3〜4×10 6個の細胞を使用して達成している。 5分間433×gで細胞懸濁液を遠心分離する。 できるだけ多くのメディアを削除してください。 2。クレオ予め室温でインキュベートしたニューロンクレオ溶液（マウス細胞を用いた場合はマウス） を直ちにラットに細胞ペレットを再懸濁する。クレオあたり100μlを使用してください ：。典型的には12匹のラットのごみは4 nucleofectionsを実行するのに十分であり、マウスのトイレ（12匹）が2 nucleofectionsを実行するのに十分である。 siRNAを/ DNAを含む各エッペンドルフチュー​​ブに細胞懸濁液100μlを転送し、P200ピペットでピペッティングにより穏やかに2〜3倍を混ぜる。 気泡を避けるように注意しながら、nucleofectioncuvetteの底にサンプル（cell-DNA/siRNAサスペンション）を追加します。 プログラムのG-013（ラット細胞の場合）またはO-005を使用してNucleofect（用マウス細胞）。一ヌクレオは約5秒かかります。 すぐにヌクレオフェクトサンプルに予熱DMEM +10％FCSの1ミリリットルを加える。 繰り返しは、他のすべての試料について2.4と2.5を繰り返します。注：最適な結果を得るために、全体のヌクレオ手続きはもう5分以上持続してはならない。 クレオキットが提供するプラスチック製のピペットを用いて、あらかじめ温めておいたDMEM +10％FCSの5ミリリットルを含む15mlチューブに各サンプルを転送します。チューブに任意の細胞片を転送することは避けてください。 5分間433×gで遠心分離サンプル。 慎重にすべての余分な培地を除去し、P20ピペットを用いてあらかじめ温めておいたDMEM +10％FCSの25〜30μlのペレットを再懸濁。培地の30以上の液を使用しないでください。 P35ディッシュのふたの内側に落下などの懸濁液をピペットで。 （ 図1も参照）完全培地の2ミリリットルを含むP35皿の上で蓋を反転します。 でインキュベーター（37℃/ 5％CO 2）で残して少なくとも5時間と7時間まで。より長いインキュベーション時間は、細胞クラスターのより良好な再凝集を可能にする。 カットチップでP1000ピペットを用いて皿の中の完全培地に蓋から吊り滴を転送します。 のDNA nucleofectionsおよびsiRNA / shRNAののnucleofectionsのため48時間、24時間、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 3。埋め込み （25ミリリットル）の完全培地を用意し、数時間、37℃/ 5％CO 2でそれをpreequilibrate。 -80℃の冷凍庫から基底膜マトリックスの凍結アリコートを取り出して、低温室で、氷上で解凍する。 それぞれが8 13ミリメートル無菌coverlipsまで含む6cmディッシュを用意クレオため。 密着フィルムで覆われたアイスボックスにお皿を置きます。これは、埋め込み手順中にマトリックスの凝固を防ぐために冷却し、カバースリップを維持することが重要である。 湿度を維持するために、15cmの皿の内側湿った組織のストリップを配置し、その付病気埋め込ま神経芽細胞を含む3つの6cmのディッシュまで保持するために使用される。 1:3の比で解凍行列に完全培地を追加します。例えば、ピペッティングすることにより、マトリックスの120μlの完全培地を40μlを混合します。マトリックスのこの量は、8つの12mmのカバーガラス上で凝集体を埋め込むために十分である。 で15mlチューブと遠心分離機に再凝集細胞クラスターを転送 5分間433×gで。 余分な培地を除去し、完全培地10μlのペレットを再懸濁します。 各無菌カバーガラス上に細胞凝集体懸濁液の2液を置き、マトリックス/完全培地混合物の18μlを加える。全体カバースリップの上に行列を広めるためにピペットチップを使用してください。 すぐに15〜20分間15cmの皿にカバースリップを含有する6cmディッシュを配置し、インキュベーター内で残す（37℃/ 5％CO 2）。行列が固化したら、そっと押しに注意しながら、各6cmディッシュに5ミリリットルの完全培地を追加ピペットチップで浮動カバースリップダウン。 神経芽細胞が細胞凝集体の外へ移動させるために37℃/ 5％CO 2で24時間インキュベートする。 4。 3D移動アッセイ免疫染色に必要な溶液を調製する。 ブロック溶液を準備します。 ヤギブロック溶液（50ml） リン酸緩衝生理食塩水（PBS） – 5ミリリットルヤギ血清 – 7.5ミリリットル 10％のトリトンX-100〜1.5ミリリットル BSA – 50 mgの H 2 O – 36ミリリットル 4℃でのフィルターと店舗定着液を準備します。 （100ml）中溶液を固定する ホルムアルデヒド（PFA） – 4グラム注意：必ずボンネットの下に、PFAを処理ショ糖 – 20グラム（オプション） 100ミリリットルまでのPBS ホットプレート上で、一定の攪拌下では80ミリリットルで、PFAを溶解PBSを65℃に維持 PFAが溶解したら、ショ糖20グラムを加える。 pHを調節する7.4（通常、溶液100ml当たり〜60μlの1 M NaOHを添加することによって）。 PBSで100ミリリットルの全量をもたらす。 免疫染色 24穴プレートにカバースリップを置きます。 PBSで2倍にカバースリップを洗浄します。 室温で45分間溶液を固定して、RMSの神経芽細胞の凝集体を固定します。 PBS 3X（ – ロッキングプラットフォーム上で5分/洗浄）でカバースリップを洗浄します。 ヤギブロック溶液で30〜60分間ブロックします。 ヤギブロック溶液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩インキュベート（所望であれば、蛍光ファロイジン（1:400）およびヘキスト色素（1:10,000）は、繊維状アクチンおよび核を視覚化するために、一次抗体溶液に添加することができる）。 PBS 3X（5分/洗浄）でカバーグラスを洗浄します。 ヤギブロック溶液中で二次抗体を希釈し、室温で2時間インキュベートする。 coversliすすぐPBSで3倍とPS（5分/洗浄） マウントは、蛍光封入剤でカバースリップし、室温で一晩乾燥さのままにしておきます。 移行解析 10倍の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡で固定したRMS神経芽細胞凝集体の画像をキャプチャする。サンプル画像中のスケールバーがあります。 定量化のためのスケールを設定するには、ImageJのツールバーの「直線」ツールを選択することにより、画像中のスケールバーを測定します。 「分析」オプションを選択し、「スケールを設定」をクリックしてください。 スケールウィンドウに「既知の距離」を設定し、すべての測定に対して同じ設定を保持するために「グローバル」ボックスをチェック。 全体集計（ 図3B）周りの6つの分野での最も遠い移行神経芽細胞に骨材の端からの距離を測定するために、ImageJのツールバーの「折れ線」ツールを使用します。唯一の孤立AGを検討分析用gregates。 各集計のために取得した6つの値の平均移動距離を計算します。 3つの独立した実験の最小値からのすべての独立した実験やプール結果に各条件のため10月20日集計を測定します。常にヌクレオ制御（ 例えば 。GFPまたは制御SH / siRNA）を挙げることができる。