Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em> במבחנה</em

הליך זה הנו בהתאם לתקנות בבריטניה המשרד הביתית (חוק נהלי בעלי החיים מדעיים, 1986). מדענים צריכים לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו ואושרו על ידי ארגוני בעלי החיים שלהם מוסדיים ולאומיים רגולציה. 1. נתיחה ודיסוציאציה של neuroblasts RMS עכברוש הכן את הפתרונות הנדרשים לנתיחה RMS ודיסוציאציה: מדיום לנתיחה (100 מיליליטר) תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) – 98.5 מיליליטר 5 M HEPES pH 7.4-0.5 מיליליטר פניצילין, סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מיליליטר ו -10,000 מיקרוגרם / מיליליטר) – 1 מיליליטר בינוני דיסוציאציה (2 מיליליטר) HBSS – 1.760 מיליליטר 10x טריפסין (2.5%) – 200 μl DNAse1 (1 מ"ג / מיליליטר) – 40 μl השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) + 10% עגל בסרום עוברי (FCS) (40 מיליליטר) DMEM -36 מיליליטר FCS – 4 מיליליטר בינוני מלא (12 מיליליטר) בינוני neurobasal – 11.46 מיליליטר תוסף B27 – 250 μl L-גלוטמין (200 מ"מ) – 125 μl גלוקוז (45%) – 165 μl 2. סנן לעקר FCS% DMEM + 10 ובינוניים המלא וpreequilibrate בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות. בתור להקריב המלטת P6-P7 חולדה (כ 12 גורים) על ידי נקע בצוואר הרחם ולערוף במספריים. עושה חתך anteroposterior בעור לאורך תפר אמצע sagittal מהאף למוח הקטן עם להב סכין מנתחים. לקלף את העור וחוזר על אותן החתך לאורך הגולגולת. להסיר בעדינות את דשי גולגולת עם מלקחיים ולהסיר בזהירות את המוח עם מרית, מקפיד לכלול את נורות חוש הריח. חותכים את שליש הזנב ביותר של המוח וזורקים אותו. קוצץ הרקמת מוח דואר ל1.4 מ"מ פרוסות העטרה עבה באמצעות מסוק רקמות. מניחים פרוסות במאכלים המכילים מדיום לנתיחה קרה ולהפריד ביניהם בזהירות באמצעות מחט. RMS מופיע כמשולש, אזור שקוף במרכז חלקי OB וכשטח קטן, עגול בפרוסות מוח הזנב יותר. חותכים את RMS מכל פרוסה עם סכין microsurgical, מקפיד להימנע מלכלול רקמה שמסביב. בגורי החולדה P7, בדרך כלל ~ 8 פרוסות מקורי ביותר (כולל OB) מכילות RMS. לאסוף את שברי RMS עם פיפטה פסטר מפלסטיק ומניח אותם בצלחת קטנה המכילה מדיום לנתיחה קרה על קרח. כאשר הנתיחה הושלמה, להעביר את שברי RMS לתוך צינור 15 מיליליטר עם טפטפת פלסטיק. עזוב את הברים להתיישב בחלק התחתון של הצינור. דיסוציאציה החלף את המדיום לנתיחה עם 2 מיליליטר של מדיום דיסוציאציה. Triturate ברי RMS בעדינות על ידי pipetting ההשעיה הבר למעלה ולמטה על 10x באמצעות פיפטה P1000. השאר את הצינור עם שברי הרקמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. פיפטה את הפתרון שוב 10x ולהבטיח כי שברים שניתקו (ההשעיה צריכה להיות מעונן). להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed. צנטריפוגה ההשעיה התא ב433 XG במשך 5 דקות. בaliquot בינתיים את הכמות הנדרשת של siRNA / דנ"א לתוך צינורות Eppendorf (בדרך כלל 3-5 DNA מיקרוגרם / shRNA או 5-9 אוליגו siRNA מיקרוגרם לnucleofection, עם זאת כמות ה-DNA / siRNA עשויה לדרוש אופטימיזציה). הסר בינוני עודפת וresuspend התא גלולה על ידי pipetting העדין ב 5 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed. לבצע ספירת תאים. מצפה ~ 1 x 10 6 תאים למוח גור חולדה. מינימום של 2.5 x 10 6 תאים נדרשים לכל nucleofection, בעודתוצאות אופטימליות מושגות באמצעות 3-4 x 10 6 תאים לכל nucleofection. צנטריפוגה ההשעיה התא ב433 XG במשך 5 דקות. הקפד להסיר כמה שיותר בינוני ככל האפשר. 2. Nucleofection מייד resuspend התא גלולה בחולדה (או עכבר, אם תוך שימוש בתאי עכבר) פתרון nucleofection נוירון מודגרות בעבר בטמפרטורת חדר. השתמש לnucleofection 100 μl הערה:. בדרך כלל המלטת עכברים של 12 גורים היא מספיק כדי לבצע 4 nucleofections והמלטת עכבר (12 גורים) היא מספיק כדי לבצע 2 nucleofections. העברת ההשעיה התא 100 μl לכל צינור Eppendorf המכיל siRNA / DNA ומערבבים בעדינות 2-3x ידי pipetting עם טפטפת P200. הוסף את המדגם (ההשעיה cell-DNA/siRNA) לחלק התחתון של nucleofectioncuvette, לטפל כדי למנוע בועות. Nucleofect באמצעות תכנית ה-G-013 (לתאי חולדה) או O-005 (עבורתאי עכבר). nucleofection אחד לוקח כ 5 שניות. מהירות להוסיף 1 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed מדגם nucleofected. חזור על שלבים 2.4 ו2.5 לכל דוגמאות אחרות. הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, ההליך כולו nucleofection צריך להימשך לא יותר מ 5 דקות. העבר כל מדגם לצינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של DMEM + 10% FCS prewarmed באמצעות פיפטה הפלסטיק הניתנת על ידי ערכת nucleofection. הימנע מהעברה כל פסולת הסלולר לצינור. צנטריפוגה דגימות 433 XG במשך 5 דקות. מוציא בזהירות את כל המדיום העודף וresuspend את הכדור ב25-30 μl של DMEM + 10% FCS prewarmed באמצעות פיפטה P20. אין להשתמש יותר מ 30 μl של מדיום. פיפטה ההשעיה כמו טיפה על הצד הפנימי של מיכסה צלחת P35. הפוך את המכסה על צלחת P35 המכילה 2 מיליליטר של מדיום שלם (ראה גם איור 1). השאר בחממה (CO 2 37 ° C / 5%) בשעה 5 לפחות ועד 7 שעות. זמן דגירה ארוך יותר מאפשר reaggregation טוב יותר של צבירי תאים. להעביר את הטיפות התלויות מהמכסה לתוך המדיום השלם בצלחת באמצעות פיפטה P1000 עם קצה חתוך. לדגור על 37 ° C / 5% CO 2 למשך 24 שעות לnucleofections DNA ו48 שעות לnucleofections siRNA / shRNA. 3. הטבעה הכן בינוני מלא (25 מיליליטר) וpreequilibrate זה על 37 ° C / 5% CO 2 למשך כמה שעות. קח את aliquots הקפואים של מטריצת קרום במרתף ממקפיא -80 ° C ו להפשיר על קרח בחדר הקר. לכל nucleofection להכין צלחת 6 סנטימטר המכילה עד שמונה coverlips סטרילי 13 מ"מ. מניחים את הכלים בתיבת קרח מכוסים בניילון. זה חשוב כדי לשמור על coverslips מגניב כדי למנוע התמצקות מטריקס במהלך הליך ההטבעה. כדי לשמור על לחות, במקום רצועה של רקמה לחה בתוך צלחת 15 סנטימטר כי wחולה לשמש כדי להחזיק עד שלוש מנות 6 סנטימטר המכילות neuroblasts המשובץ. הוסף בינוני מלא למטריצה ​​מופשרת ביחס 1:3. לדוגמא, לערבב 40 μl של מדיום להשלים עם 120 μl של מטריצה ​​על ידי pipetting. סכום זה של מטריצה ​​מספיק להטבעת מצרפים על שמונה coverslips 12 מ"מ. העבר את צבירי תאי reaggregated לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 433 XG במשך 5 דקות. הסר בינוני עודפת וresuspend את הכדור ב10 μl של מדיום שלם. מניחים 2 μl של השעיה המצרפי תא על coverslip כל סטרילי ולהוסיף 18 μl של מטריצה ​​/ תערובת בינונית מלאה. השתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את המטריצה ​​על כל coverslip. מייד מניח את צלחת 6 סנטימטר המכילה coverslips בצלחת 15 סנטימטר ולהשאיר בחממה (CO 2 37 ° C / 5%) ל15-20 דקות. כאשר המטריצה ​​יש הקרושה, בעדינות להוסיף 5 מיליליטר בינוני מלא לכל טיפול לקיחת מנה 6 סנטימטר לדחוףאת כל coverslip צף עם קצה פיפטה. דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 לתת neuroblasts להעביר מתוך אגרגטים התא. 4. 3D הגירת Assay הכן את הפתרונות דרושים לimmunostaining. הכן את פתרון הבלוק: פתרון לחסום עיזים (50 מיליליטר) בופר פוספט (PBS) – 5 מיליליטר סרום עיזים – 7.5 מיליליטר 10% טריטון X-100-1.5 מיליליטר BSA – 50 מ"ג H 2 O – 36 מיליליטר סינון ולאחסן ב 4 ° C. הכן את פתרון תיקון: תיקון פתרון (100 מיליליטר) Paraformaldehyde (PFA) – 4 גרם זהירות: תמיד להתמודד עם PFA מתחת למכסת מנוע סוכרוז – 20 g (אופציונלי) PBS עד 100 מיליליטר על פלטה חשמלית ותחת בחישה מתמדת לפזר את PFA ב80 מיליליטר PBS נשמר ב65 ° C. ברגע שPFA נמס, להוסיף 20 גרם של סוכרוז. התאם ל-pH7.4 (בדרך כלל על ידי הוספה ~ 60 μl 1 M NaOH לפתרון 100 מיליליטר). להביא עד נפח כולל של עם PBS 100 מיליליטר. Immunostaining הנח coverslips בצלחת 24 גם. יש לשטוף coverslips עם PBS 2x. תקן מצרפי neuroblast RMS עם פתרון תיקון ל45 דקות בטמפרטורת חדר. יש לשטוף coverslips עם 3x PBS (5 דקות / לשטוף – על פלטפורמת נדנדה). חסום לדקות 30-60 עם פתרון לחסום עז. מדולל נוגדנים עיקריים בפתרון לחסום עז ודגירת הלילה בשעה 4 ° C. (אם תרצו, phalloidin ניאון (1:400) ולצבוע Hoechst (1:10,000) ניתן גם להוסיף לפתרון הנוגדן הראשוני לדמיין אקטין וגרעיני פילמנטיות). יש לשטוף coverslips עם PBS 3x (5 דקות / לשטוף). מדולל נוגדנים משני בפתרון לחסום עז ודגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. יש לשטוף coversliנ.ב. עם 3x PBS (5 דקות / לשטוף) הר coverslips עם מדיום הרכבה ניאון ולהשאיר לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת חדר. ניתוח הגירה צלם תמונות של אגרגטים neuroblast RMS קבועים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 10X. כולל סרגל קנה מידה בתמונה לדוגמא. כדי להגדיר את קנה המידה לכימות, למדוד את סרגל קנה מידה בתמונה על ידי בחירה באפשרות "הקו ישר" בסרגל כלי ImageJ. בחר את האפשרות "לנתח" ולחץ על 'קבע את קנה המידה ". בחלון קנה המידה להגדיר את 'המרחק הידוע "וסמן את התיבה' הגלובלית 'כדי לשמור על אותן ההגדרות לכל המדידות. השתמש בכלי 'הקו מקוטע' בסרגל כלי ImageJ כדי למדוד את המרחק מהקצה של המצרף לneuroblast היגרה הרחוקה ב6 מגזרים שונים ברחבי הצירוף כולו (איור 3). שקול רק AG מבודדתgregates לניתוח. חישוב מרחק הגירה ממוצע מהערכים 6 התקבלו לכל המצרפי. מדוד 10-20 מצרפים עבור כל תנאי בכל עצמאי תוצאות ניסוי ובריכה ממינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים. תמיד כולל שליטת nucleofection (למשל. GFP או sh שליטה / siRNA).