Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen in Adult zebravis met fluorescente kleurstoffen
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
Als retrograde etikettering retinale ganglioncellen (RGC) kan RGC somata isoleren van stervende sites, is het uitgegroeid tot de gouden standaard voor het tellen van RGC in RGC overleving en regeneratie-experimenten. Veel studies zijn uitgevoerd bij zoogdieren te RGC overleving onderzoek na oogzenuw letsel. Echter, retrograde labeling van RGC bij volwassen zebravissen nog niet gerapporteerd, hoewel sommige alternatieve methoden celaantallen kan tellen retinale ganglioncellen lagen (RGCL). Gezien de geringe omvang van de zebravis schedel volwassen en het hoge risico op overlijden na een analyse op de schedel, de schedel openen we met behulp van zuur-etsen en sluit het gat met een lichtuitharding band, die aanzienlijk kunnen verbeteren de overlevingskansen. Nadat de absorberende kleurstoffen voor 5 dagen, zijn bijna alle gelabelde RGC. Aangezien deze methode niet nodig om de optische zenuw doorsnijden, is onvervangbaar in het onderzoek van RGC overleving na oogzenuw verpletteren in volwassen zebravissen. Hier introduceren weDeze methode stap voor stap en geven representatieve resultaten.
Introduction
Als volwassen zebravissen hebben een sterk vermogen om axonen regenereren na oogzenuw letsel 1, een goede methode om te tellen de hele RGC is essentieel voor RGC overleving en regeneratie 2 evalueren. Op basis van de methode van retrograde etikettering RGC in zoogdiercellen en goudvissen 3-5, construeerden we de methode om RGC etiketteren van de tectum bij volwassen zebravis. Voor volwassen zebravissen, moeten twee kritieke technische problemen worden opgemerkt: de schedel van volwassen zebravissen is zeer klein 6; ze leven onder water. Hier behandelen we de schedel met etsmiddel die de gevaren van het boren van 5 minimaliseert. Dan, verzegelen we het gat met licht uitharden band die dierlijke overleving verbetert na de operatie.
Voorheen werden verschillende andere technieken aangenomen RGC Aantal indirecte manieren. HE kleuring in het netvlies secties labels alle soorten cellen in het RGCL 7. Antilichaam etikettering in de hele rEtina, zoals eilandje-1, kan ook een label amacrinecellen 8. Hoewel retrograde label van de oogzenuw stomp alle RGC in het netvlies kan labelen, kan het niet worden in de crush model aangenomen, want het veroorzaakt extra schade aan de oogzenuw. Profiteren van retrograde label uit de tectum, hebben we RGC overleving en regeneratie onderzocht in oogzenuw verpletteren. Resultaten tonen aan dat bijna alle RGCs overleefd meer dan 90% van RGC geregenereerd het tectum in de eerste week van de crush model 9.
Om alle RGC succes label werd Dil pasta gekozen na vergelijking met enkele andere commerciële kleurstoffen 10. Ten eerste wordt speciaal ontworpen voor in vivo weefsel labeling. Ten tweede is een lipofiele kleurstof die niet kan diffunderen in water. Bovendien kan deze fluorescentie aanhouden lang waardoor het een uitstekende kandidaat voor RGC overleving onderzoek maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrograde etikettering van RGC is belangrijk RGC overleving onderzoek in zoogdieren, maar niet is gebruikt bij zebravis. De alternatieve werkwijzen, HE kleuring 7 en antilichaamkleuring 8, niet gouden standaard voor het tellen RGC nummer en transgene lijnen met RGC gemerkte nog niet is aangelegd 12, 13. In deze video, introduceren we een methode om label RGC retrograde in het netvlies van volwassen zebravissen. Hoewel ongeveer 1% van axonen projecteren reukkwab en andere gebieden 1…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
Referencias
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
