JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medio ambiente

Potansiyel Toprak Ekstrasellüler Enzim Aktivitelerinin Yüksek verim Florimetrik Ölçme

Published: November 15, 2013
doi:
10.3791/50961
, , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering,University of Colorado

Summary

Toprak dışı enzim faaliyetlerinin muhtemel değerlerini ölçmek için, bir floresan boya bağlanmıştır sentetik alt-tabakalar toprak örneklerinin eklenir. Floresan boya yüksek flüoresans daha fazla alt bozulmasını gösteren bir enzim-katalizörlü reaksiyonu ile alt-tabakadan salınmaktadır gibi enzim aktivitesi ölçülmüştür.

Abstract

Kirlerin ve diğer ortamlarda mikroplar için enerji ve besin asimile edilebilir, böylece organik makromolekülleri depolimerize ve hidrolize etmek için hücre dışı enzimler üretir. Toprak mikrobiyal enzim aktivitesini ölçmek toprak ekosistem işlevsel dinamiklerini anlamak çok önemlidir. Floresans enzim tahlilinin genel kavramı sentetik C-, N-, veya bir floresan boya ile bağlı P açısından zengin alt tabakalar toprak örneklerinin eklenir olmasıdır. Zaman sağlam, etiketli substratlar floresan değildir. Enzim etkinliği fluoresan boyalar onları floresan sağlar kendi alt-tabakalar, ayrıldı olarak floresansta artış olarak ölçülür. Enzim ölçümleri molarite veya etkinliğinin birimleri olarak ifade edilebilir. Bu tahlili gerçekleştirmek için, toprak harç maddeleri, pH tampon maddesi ile toprak birleştirerek hazırlanır. PH tampon maddesi (genellikle 50 mM sodyum asetat ve 50 mM Tris tamponu), en iyi kir sa eşleştirmek için tamponunun belirli asit ayrışma sabiti (pKa) için seçilmiştirmple pH. Toprak bulamaçlar floresan (yani C-N-ya da P-zengin) alt-tabaka olarak etiketlenmiş bir sınırlayıcı olmayan bir miktarı ile aşılanır. Deneyde toprak harç maddelerin kullanılması, enzim ve alt tabaka difüzyon sınırlamaları en aza indirmek için hizmet eder. Bu nedenle, alt-tabaka bir sınırlama farklılıklara, difüzyon oranları, ve toprak pH koşulları için, bu deney, kontroller, bu yüzden (örnek başına) enzim konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak potansiyel bir enzim aktivitesi oranlarının saptanması.

Floresan enzim tahlilleri genellikle spektrofotometrik (yani kolorimetrik) tahlillerinde daha duyarlı, ancak kirlilikler ve ışığa maruz birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir; böylece floresan tabakaları kullanırken dikkatli olunmalıdır. Alt tabakalar sınırlayıcı değildir Benzer şekilde, bu yöntem sadece laboratuar koşulları altında potansiyel enzim aktivitesini değerlendirir. Haçı temsil eden verileri yorumlarken dikkatli kullanılmalıdırYerinde toprak tipi ve sıcaklık gibi farklı sıcaklıklar veya toprak türleri ile-site karşılaştırmalar enzim kinetiği etkileyebilir.

Introduction

Toprak bakteri, mantar, ve arkelerin tarafından üretilen hücre dışı enzimler (EES) sayısız biyokimyasal süreçlerde ve işleme, istikrar, ve karasal ekosistemler 1 toprak organik madde ve besin döngüsü istikrarsızlık merkezi vardır. EES üreterek, toprak mikroplar ayrıştırmak ve böylece bitki ve mikroplar toprakta mevcut besin asimile sağlar önce bağlı mikro ve makro besinleri, özgürleştirici, daha küçük çözünür moleküller halinde polimerik organik madde dönüşümü. Doğrudan enzimleri tespit ve ölçmek çok zordur çünkü EES, öncelikle laboratuvar deneylerinde 2-4 faaliyetlerini ölçerek, yıllardır çalışılmıştır.

Hücre dışı enzim aktivitesi (EEA), en kuvvetli enzimler ve karşılık gelen alt-tabakaların konsantrasyonu ile kontrol edilir. Bolluğu, farklı C-, N-ve P-topraklarda bozundurucu enzimler, çok sayıda faktör tarafından kontrol edilir imikrobiyal biyokütle, topluluk kompozisyonu, yüzey kullanılabilirliği, mikroklima ve stokiyometrik taleplerini 5,6 ncluding. Ancak, toprak ortamı içinde in situ EEAS da boyut, yüzey kullanılabilirliği açısından, sıcaklık 7,8, toprak killeri ve hümik özellikleri 2'ye enzimlerin bağlayıcı ve sonuçta aktif enzim havuzu düzenleyen difüzyon kısıtlamaları 9, etkilenir ve devir oranları 10-12. Farklı çevre siteler arasında toprak mikrobiyal şekilde yorumlamak için laboratuvar enzim testiyle nedenle, yerinde toprak koşullarında kabul önemlidir.

EEA Birçok farklı sınıflar (daha fazla detay için "Reaktifler Tablo Listesi" bakınız) sentetik yüzeylerde kullanarak çeşitli laboratuar deneylerinde belirlenebilir. Bazı protokoller w, bir spektrofotometre ile tespit edilebilir bir kolorimetrik reaksiyon kuple edilir deneylerde alt tabakaları kullanırbir floresan parçasına bağlanmıştır alt tabakaları kullanır, burada tarif protokol de dahil olmak hile diğerleri. Floresan EE deneyler tipik haliyle kolorimetrik analizler göre (büyüklük sırasına göre) daha hassastır (sentetik alt-tabaka ile bağlanmış bir kromojenik grubu kullanan) 12-14. Bir ilgi bileşiğinin miktarı ile ilgilidir tespit ve en tespit potansiyel enzim aktivitesi için diğer ilgili: EEA saptanmasında duyarlılık iki yönü içerir. Kolorimetrik p-nitrofenol için yöntemler, (PnP) dayalı tahliller geçmişte bulunabilir 15,16 çalışır. Kısaca, toprak içinde en iyi ya da alan uygun sıcaklık ve pH inkübe edilir (tipik olarak <2 mm ve hava ile kurutularak için elenmiş). Serbest reaksiyon ürünü bir spektrofotometre 14 ile kolorimetrik tespit edildiği hızı. Floresan enzim deneylerinin yüksek hassasiyet substr ilişkili fluorojenik parçası ayırma daha hassas bir şekilde tespit kısmen kaynaklanmaktadırBelirli bir dalga boyundaki bir spesifik kromojenik kısmının ayrılmasından sonra bozulmasını yerine kayıt absorbans yedi. En yaygın olarak kullanılan sentetik floresan göstergeleri 4-metilumbelliferon (MUB) 17 ve 7-amino-4-metilkumarin (MUC) 18,19 vardır. MUC-bağlanmış alt tabakalar genellikle bu tür proteinlerin ve / veya amino asitler gibi N-zengin sentetik alt-tabakalar ile ilişkilidir. Floresan teknikleri ilk su numuneleri 20,21 için geliştirilen ve topraklara uygulama sinyal söndürme ve müdahale 22,23 için denetimler gerektirir edildi. Deneyler Ya büyük hacimli geleneksel "masa üstü" kimyası kullanılarak yapılabilir, veya artmış verim, ancak muhtemelen daha yüksek ölçüm hatası ile, mikro göre protokollerinde de kullanılabilecektir. Topraklarda 24 EEAS floresan tespiti için çeşitli yaygın olarak anılan protokoller olsa da, birçok laboratuvar genellikle yanlışlıkla veya bağlı farkı, bu protokoller üzerinde ince varyasyonları istihdamlaboratuar ekipmanları veya reaktiflerdeki s. Protokollerinin ayrıntıları görünüşte küçük farklılıklar şiddetle EEAS 25,26 ölçülebilir etkiler ve standart enzimlerin eksikliği, farklı laboratuarlar arasında deneyleri kalibre zorlaştırmaktadır. Böylece, EEA testlerin standardizasyonu teşvik detaylı protokollerin yayılması için önemli bir ihtiyaç vardır.

Protokolde, toprak numuneleri, bir pH tampon maddesi ile toprak örnekleri birleştiren ve bir karıştırıcı ile homojenize edilmesi suretiyle hazırlanır. Bulamaçlar daha sonra, floresanla işaretlenmiş sınırlayıcı olmayan bir miktarı ile aşılanır = C-,-N ya da P açısından zengin alt tabaka, ilgi konusu özel bir araştırma söz bağlı olarak seçilir. Enzim deneylerde toprak bulamaçları kullanarak alt-tabaka difüzyon sınırlamaları en aza indirmek için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Flüoresan kısımları kendi ilgili bir substrattan ayrılmaktadır kadar söndürüldü, ve floresan boya alt-tabaka b serbest olarak bu şekilde enzim aktivitesi tespit edilebiliry bir enzim katalizli reaksiyon. Zaman içinde artan flüoresan yoğunluğu, enzim-katalizörlü reaksiyon oranını yansıtır.

Floresans enzim tahlilinin genel kavramı flüorojenik yarımı (flüoresan boya) ile bağlı sentetik alt-tabakalar, toprak örneği 27 eklenir olmasıdır. Enzim-alt tabaka katalize bozulması sırasında bağ floresan boya ve alt-tabaka arasında keser. Substrattan serbest floresan boya sonuç olarak enzim aktivitesinin dolaylı bir değerlendirme olarak kullanılır ve boyanın floresans yoğunluğunu tespit etmek için bir mikro-plaka okuyucu kullanarak ölçülebilir. Serbest kalan boya farklı bir dalga boyunda ışık emici sonra bir dalga boyunda ışık yayan olarak Kısaca, floresan ölçümü gerçekleştirilir. Floresan yoğunluğu uyarı ve tespit hem edebilen bir plaka okuyucu tarafından kaydedilir. Enzim aktivitesi, daha sonra bilinen bir floresan boya conce göre tayin edilebilirDeneyde (örneğin 4-metilumbelliferon (MUB) ya da 7-amino kullanılan alt-tabakanın özgül flüorojenik kısmı için floresan yoğunlukları standart bir seyreltme eğrisi referans ile birlikte alt-tabaka (örneğin, sentetik bir alt tabakanın bilinen bir miktarda toprak numunelere ilave edilen) ntrations -4-metilkumarin (MUC)). (Enzim aktivitesi ölçümü ile ilgili özel ayrıntılar için protokol bölümüne bakınız).

Laboratuvar toprak enzim tahlilleri mikrobiyal topluluk fonksiyonunu değerlendirmek için yararlıdır, ancak kullanıcılar 10 tanıması gereken birkaç teknik sınırlamalar vardır. Floresan deneyleri ışığa maruz kaldığında kirlilikler ve / veya birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir, bu nedenle floresan Alt tabakalar 25 tutarken dikkatli olunmalıdır. Toprak çamurlarında kir tanecikleri ve / veya organik madde de söndürme etkisi 26 olarak bilinen floresan yoğunlukları, engelleyebilir.Bundan başka, laboratuar deneyleri, enzim sadece laboratuar koşulları altında potansiyel EEAS değerlendirir. In vitro deneyler, alt-tabaka ve bolluk difüzyon sınırlayıcı olmayan koşullar altında EEAS ölçer. Bu nedenle, bu deneyleri tarafından sağlanan veri in situ toprak koşulları altında 10 EEAS için iyi bir vekil olmayabilir. Genel olarak, enzim aktivitesi, toprak tipi benzer olan nispi karşılaştırması için çok yararlıdır. Fiziksel ya da kimyasal özellikleri açısından farklılık gösteren etkinlikleri kirlerin arasındaki karşılaştırma, bu yöntem kullanılarak, ancak, dikkatli kullanılmalıdır. Bu, toprak tipi, sıcaklık farklılıkları büyük ölçüde yerinde enzim kinetik durumunu değiştirebilir olmasından kaynaklanmaktadır. Diğer bir sınırlama, nispeten az sayıda alt-tabakalar (doğal ortamı ile karşılaştırıldığında) ticari olarak temin edilebilir olmasıdır. Ayrıca, enzim deneyleri için kullanılan alt-tabakalar, sentetik doğru mevcut veya availabl toprak tabakaları temsil etmeyebilir (kolay eriyen) nispeten basitin situ e. Dikkate alınacak diğer bir faktör toprak bulamaçlarından kullanılarak in situ koşullarında 2 altında aktif olmayabilir (yani organik madde ya da killerin hareketsiz) bazı stabilize enzimlerin aktivitesini dahil olacaktır. Laboratuvar enzim tahlilleri de toprak (enzim ciro oranları) veya toprak enzimleri üreten özel mikrobiyal türler konusunda bilgiler enzimlerin kalıcılığı ile ilgili bilgi vermemektedir.

Protocol

1.. Tahlil Set-up Etiket 3 derin kuyu plakaları: "Örnek", "MUB standart" ve "MUC standart". Her bir standardı (0, 2.5, 5, 10, 25, 50, ve 100 mcM MUB) ve alt tabaka ayrı ayrı temiz, prelabeled rezervuarların içine (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) (satırlar) odaklı dökün . MUB standart plaka (Tablo 1) karşılık gelen kuyu içine uygun MUB standart Pipet. MUB standart plaka sıra A içine 0 iM Mub Pipet 200 ul. Pipet 200 MUB standart plaka sıra B içine 2.5 mcM Mub ul. MUB standart plaka sıra C içine 5 mcM Mub Pipet 200 ul. MUB standart plaka sıra D içine 10 mcM Mub Pipet 200 ul. MUB standart plaka sıra E içine 25 mcM Mub Pipet 200 ul. MUB standart plaka sıra F içine 50 iM Mub Pipet 200 ul. 100 μ Pipet 200 ulMUB standart plaka sıra G içine M MUB. MUC standart plaka ilgili kuyulara MUC standartları 1.3.8 – tekrarlayın 1.3.1 adımları. Her toprak örneği için hazırlık toprak çamurlar. Blender içine alan nemli toprakta 2.75 g tartılır. 50 mM tampon 91 ml ilave edilir. 1 dakika boyunca yüksek üzerinde karıştırın. En azından geniş bir karıştırma çubuğu ile 8-kanal pipet gibi temiz bir cam kasenin içine blender içeriğini dökün. Düşük toprak çamurunu karıştırmak, heyecan plaka üzerine yerleştirin. Pipet Örnek plakasının (Tablo 2) birinci sütuna toprak çamurunun 800 ul. MUB standart ve MUC standart levhalar (Tablo 1) 1 st sütuna tekrar edin. DI H 2 O ile blender, heyecan plaka ve karıştırma çubuğu durulayın veya toprak örneklerinin arasında tampon. Sonraki her toprak örneği (Tablo 1 ile sonraki sütuna hareket, her bir örnek için) 1.4.7 ve – Tekrar 1.4.1 adımları2). Örnek plaka (Tablo 2) karşılık gelen oyuklarına (bu örnekte, 200 uM konsantrasyonu), uygun alt-tabakanın Pipet. Numune plaka sıra A içine BG substrat Pipet 200 ul. Pipet Numune plaka sıra B içine CB substratın 200 ul. Numune plaka satır C içine NAG substratı Pipet 200 ul. Pipet Numune plaka sıra D içine PHOS substratın 200 ul. Pipet Numune plaka satır E içine XYL substratın 200 ul. Numune plaka satır F içine AG substrat Pipet 200 ul. Numune plaka satır G içine LAP substrat Pipet 200 ul. Her inkübasyon sıcaklığı numune plaka için 1.5.7 – tekrarlayın 1.5.1 adımları. 2. Deney plakası inkübasyonu Derin kuyu plakaları ("örnek", "MUB standart" ve "MUC standart Seal4 ;) plaka paspaslar. Çözelti iyice karıştırılır kadar elle her (mühürlü) plaka invert (~ 10x). Gerekli inkübasyon süre (Tablo 3) uygun inkübatör tabak yerleştirin. Zaman 0 olarak ilk defa kaydedin. Eğer inkübatör (Tablo 3) gelen plaka kaldırmak için ne zaman biliyor bu yüzden de uygun inkübasyon sürelerini kaydetmek. Her bir kuluçka süresi, santrifüj ~ 2900 x g'de 3 dakika boyunca sızdırmaz plakalar sonunda. Sertifika sonra, (bir siyah plaka, her kuluçkalanmıştır derin kuyu plaka için kullanılacaktır), siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar içinde karşılık gelen kuyu içine kuluçkaya derin sağlam plakanın her çukuruna 250 ul aktarın. Bu, siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalarda aynı kuyu (örneğin, A1, … A12, vb) içine kuluçkaya derin kuyulu plakalarda numune aktarmak için önemli olan (Tablo 1, 2). 3. Floresan ölçümleri onMikrotabak Fluorometer Kullanılan fluorometrik plaka okuyucusu için üreticinin talimatlarına, 450 nm'ye 365 nm ve emisyon dalga boyu eksitasyon dalga boyu: (veya uygun filtreler kullanın) sonra. Florometre üzerinde üç tabak okuyun. Önemli: numuneler ve standart levhalar (yani MUB veya MUC) aynı kazancı kullanılarak okunması gerekir. Otomatik kazanç spektrofotometre ayarlayın ve MUC ve MUB Standart plakaları okuyun. Set kılavuzuna kazanç ve optimum dan sonraki en düşük sayıya değeri azaltmak, her standart plaka için, en yakın beş yuvarlanır. Her bir plaka için 2x tekrarlayın. Otomatiğe kazanç ayarlayın ve örnek plakayı. Standart plakaları (örneğin MUB ve MUC) her biri için en yüksek kazanç maç için elle örnek plaka yeniden çalıştırın. 4. Veri Analizi MUB için tablo içine standart eğri floresan verilerini girin (Tablo 4a) Ve MUC standart (Tablo 4b) (Umol) 'den (uM) konsantrasyonları dönüştürme (Tablo 4a ve 4b). Her numunenin standart eğri floresan veri, eğim, y-kesişim, ve R Mub ve MUC (ľmol) standart konsantrasyonları 2 değerlerini hesaplamak. Uygun R2 değerleri her bir numune için 0.98 aşmalıdır (Tablo 4a ve 4b). Floresan bağımlı değişken (y-ekseni) ve standart bir konsantrasyonu (umol) bağımsız değişken (x-ekseni) (Şekil 1) olarak grafiğe olarak çizilmiştir okumaları ile, bir dağılım arsa standart eğrileri görselleştirmek için yararlı olabilir. Bu potansiyel EEAS içine numune + madde ham floresan verileri hesaplamak için MUB ve MUC standart eğrisi eğimi ve y kesişim noktası değerlerini kullanacaktır. Önce yeni bir elektronik tabloya örnek + tabaka ham floresan verileri girin (Tablo 5a gerekir </strong>). Sen de her bir numune için inkübasyon süresi (saat) ve toprak kuru ağırlığı (Tablo 5b) girmeniz gerekir. Numuneler 25 ° C (Tablo 3) ile inkübe edildi çünkü bu örnekte girilen zaman değerleri, 3 saattir, dikkat edin. Karşılık gelen örnek floresans değerlerinden standart eğri kesişim noktası değerlerini çıkarma ve daha sonra karşılık gelen standart eğri (Tablo 5 C) eğimi ile bölün. [Y = numune floresan ham okuma; MUB veya MUC standart bir eğriden b = kesmek, m = MUB ikinci eğim: x = (Yb) / m; Bunu gerçekleştirmek için, örnek enzim konsantrasyonu (x) için çözmek için standart bir çizgi denklemi yeniden düzenlemek veya MUC Standart eğri]. 91 ml (toprak harç madde içinde kullanılan tampon hacim) (Tablo 5d) ile, yukarıda adım 4.3.1 dan, örnek umol çarpın. [Enzim AMT: bölmek değeri örnek özgü inkübasyon süresi ve kuru toprak kütlesi (Tablo 5e) adım 4.3.2 elde. (& #956; mol) ml x 1.000 x 0,8 91 ml x inkübasyon (saat) kuru toprağı (g) x x] Not: 0.8 ml de her birinde kullanılan harç maddenin hacmi, 1000 ve de her bir gerçek toprak miktarı için düzeltir. İstenilen birimleri (nmol aktivite / g kuru toprak / saat) (Tablo 5f) almak için 1000 adım 4.3.3 elde değerini çarpın.

Representative Results

Enzim tahlilleri potansiyel EEAS ölçmek için ve benzeri örnekleri arasında faaliyetlerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Burada, yüksek CO 2 ve ısıtma tedavileri (EHN) (Şekil 2-6) maruz bırakıldı topraklara ortam iklim koşulları (ACN) deneyimli toprakları karşılaştıran deneysel bir iklim çalışmanın temsilcisi sonuçlarını sunmak. Bütün parsellerde bitki örtüsü Lag C4 çim Bouteloua grasilis (HBK) hakim bir kuzey karma ot kır özelliği vardı. ve iki C3 çimenler, Hesperostipa comata Trin ve Rupr. ve Pascopyrum smithii (Rydb.), bitki örtüsünün yaklaşık% 20 ayak otuna ve forb'un oluşmaktadır. Site açıklaması ve alan deneysel tasarım ile ilgili daha fazla bilgi referanslarda 28-30 bulunabilir. Topraklar değiştirilmiş iklim c yanıt olarak toprak EEAS değerlendirmek için bir 1.5 cm çaplı göbek kullanılarak tedavi parsellerin her birinde iki farklı derinlikte (0-5 cm ve 5-15 cm) toplandışartlarından. Bizim örneklerde (yani 2-6 Şekiller), örneklem büyüklüğü (N = 3). Ne olursa olsun, bu minimum numune boyutu, varyasyon çoğu durumda nispeten küçük (hata çubukları ile gösterildiği gibi) ve güçlü bir tedavi araziler arasındaki potansiyel EEAS değişkenlik gösterir. Varyans analizi (ANOVA) ve Tukey çoklu post hoc karşılaştırmalar analizi tedavi araziler ve derinlikler arasında enzim aktivitesinde önemli değişimleri tespit etmek için kullanıldı. Aşağıdaki temsili sonuçlar bu yüksek verimlilik, flüorometrik deneyi (2) nasıl AEA stoikiometri (3) ilişki ekosistem düzey süreçlere göstergesi olabilir ve, topraklarda (1) genel EEA'yı test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için verilmiştir inkübasyon sıcaklığı ve EEA arasındadır. Toprak AÇA en yaygın toprak besin döngüsü için mikrobiyal fonksiyonu vardiya ilişki incelenmektedir; iklim değişikliği, bitki topluluğu s cevaben mikrobiyal besin taleplerini değerlendirmek için yararlı göstergelerihifts, ve daha geniş 31-33 işleyen ekosistem. AÇA stoikiometri daha yakın çevre koşullarına 5 tekabül potansiyel mikrobiyal besin dengesizlikleri değerlendirmek için ekolojik stokiyometrik teori ve ekoloji metabolik teorisini kesişen tarafından toprak biyokimyasal besin döngüsünü değerlendirmek için bir göstergesi olarak kabul edilmiştir. Çeşitli çalışmalar geniş stokiyometrik oranlar besin büyüme sınırlamalar 34-36 göstergesi olduğunu ileri sürmüşlerdir ve toprak besin sınırlı olmak gibi, mikroplar eksik besin elde etmek için 37 özel enzimleri üretmek için metabolik kaynak ayırarak cevap. Ecoenzymatic C: N: P stoikiometri oranları çeşitli çevresel tedirginlikler yanıt potansiyel mikrobiyal topluluk besin talep göreli kaymalar tespit etmek ve böylece yararlı 5. Son olarak, EEAS sıcaklık duyarlılıkları toprak mikrobiyal topluluk fonksiyonel çeşitlilik muhtemel sıcaklık değişimleri nasıl etkilediğini değerlendirmek için yararlı olabilir <> 7,38 sup. Enzim sıcaklık duyarlılığı geniş tek bir enzim sınıfı için topraklar arasında değişebilir, ve enzimleri üreten mikrobik topluluk, tarihi 7 iklim koşulları kaymalar karşılık gelen enzim aktivitesi değişimleri göstermiştir. Böylece EES'nin termal ekoloji ile ilgili enzim aktivitesi sorular 39,40 değiştirir iklim cevaben mikrobiyal işlevsel dinamikleri ve toprak altında bir ekosistem süreçleri değerlendirmek için yararlı bir yol olabilir. Bu örnekte, potansiyel C-, N-, ve 0-5 cm toprak derinliklerinde tahlil P-enzim satın alma faaliyetleri deneysel tedavi (Şekil 2a) tarafından fark yoktu. Ancak, 5-15 cm toprak derinliklerinde, çeşitli potansiyel EEAS anlamlı (Şekil 2b) farklılık yoktu. Örneğin, β-1 C-bozundurucu enzimler ,4-glukosidaz ve β-D-selobiyohidrolaz (0,038 ≤ p; Şekil 2b) EHN parsellerde düşüktü ACN araziler ile karşılaştırıldığında. N ve P madencienzimler (sırasıyla, β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase ve fosfataz) alizing (0,012 ≤ p; Şekil 2b) EHN parsellerinde de düşüktü 5-15 cm derinlikler ACN ile karşılaştırıldığında. Toplamını hesaplanması ve komplo tüm C-, N-, veya P-bisiklet potansiyel EEAS potansiyel toprak C-, N-, ve / veya P-döngüsü (Şekil 3) ile ilgili daha geniş kalıplarını gözlemlemek için yararlı bir yaklaşım olabilir. Bu örnekte, β-1 ,4-glukosidaz, β-D-sellobiyohidrolaz, β-Xylosidase ve α-1 ,4-glukosidaz potansiyel EEAS toplamı potansiyel C bisiklet aktiviteleri göstermek için hesaplanmıştır. Β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase ve L-lösin aminopeptidaz toplamı potansiyel N bisiklet aktiviteleri göstermek için hesaplanmıştır. Fosfataz potansiyel P bisiklet faaliyetlerini temsil etmek için kullanılmıştır. Bu örnekte, toplam C-, N-ve P-bisiklet için potansiyel EEAS Ehn 5-15 cm toprak derinliklerinde ACN araziler göre araziler (Figu alt trendre 3). Ancak, bu eğilim (0,046 ≤ p; Şekil 3), toplam N ve P bisiklet faaliyetleri için tek anlamlı oldu. Toprak EEAS anlamlı (Şekil 3) 0-5 cm toprak derinliklerinde tedavi araziler arasında farklılık yoktu. Bu örneğin sonuçları toprak derinliğine karşılık olarak enzim aktivitesi fonksiyonel bir grupta bulunan zıt eğilimleri tedavi parsellerin arasında (yani C-N-ya da P-bozundurucu enzimler) (EHN genel ACN) göstermektedir. Örneğin C-, N-ve ortam araziler (ACN) in P-düşürücü toprak EEAS ters bir desen (Şekil 3a-c gösterdiği yüksek bir CO2 ve ısıtma (EHN), maruz kalan topraklar göre daha düşük derinlikte daha yüksek bir trend .) Enzim stoikiometri ortamda (Şekil 4) potansiyel enzim faaliyetlerini değerlendirmek için başka yararlı bir yaklaşımdır. Besinler için mikrobiyal talep çevre ile ilgili olarak mikrobiyal biyokütle elemental stokiyometrisi ile belirlenirbesin durumu 32. Benzer şekilde, mikrop ekolojik stoikiometriye 41 olarak adlandırılır topraktaki besin ortamlarında taleplerini karşılamak için özel enzimler (örneğin C-N-ya da P-bozundurucu enzimler) üretir. Potansiyel EEAS oranı mikrobiyal besin taleplerini değerlendirmek için bir yoludur. Örneğin, ikisi arasında bir 1:1 oranında (örneğin C: N besin satın alma) fonksiyonel gruplar enzim mikrobiyal biyokütle C göz önüne alındığında N için talep C talebin göreli olarak yüksek olduğunu öneririm: topluluk düzeyinde N oranları tipik olarak 8:01 42'dir. Bu örnekte, toprak enzim stokiyometri C: N, C: P veya N: P aktiviteleri belirgin olarak 0-5 cm toprak derinliklerine (Şekil 4a-c) de tedavi araziler arasında farklılık gösterir. Ancak, potansiyel enzim C: P ve N: P oranları Ehn yüksekti 5-15 cm toprak derinliklerinde ACN araziler göre araziler (p = 0.05; Şekil 4b ve 4c). Bu gözlem göstermektedir ki oradanispeten daha yüksek P mineralizasyonu EEAS C ve N AEA ile karşılaştırıldığında 5-15 cm toprak derinliklerinde (Ehn karşılaştırıldığında) ACN araziler. Enzim C: N nedeniyle Ehn kıyasla daha düşük derinlikte ACN parsellerde daha yüksek potansiyel C EEAS için (Şekil 4a): Yok edinimi faaliyet oranları yüksek C toplam C EEAS gösterdiği benzer bir eğilim gösterdi. Sıcaklık kuvvetle toprak EEAS etkileyebilir. Oysa, tipik laboratuvar deneylerinde, toprak enzimleri yerinde sıcaklık koşullarında uygun olmayabilir tek bir sıcaklıkta ölçülür. Bizim floresan enzim tahlili yöntem bize karşılaştırma için birden fazla laboratuvar inkübasyon sıcaklıkları dahil ederek yerinde sıcaklık etkileri dikkate sağlar. Birden sıcaklıklarda laboratuvar inkübasyonları kullanarak bize Arrhenius arsa ve Q 10 hesaplamaları kullanarak sıcaklık-bağımlı enzim kinetik verileri analiz etmeyi sağlar. Arrhenius arsa aktivasyon enerjisini görselleştirmek için kullanılan ve bizi çizilirx ekseni üzerinde derece Kelvin (1 / K) dönüştürülür ters sıcaklığın bir fonksiyonu olarak enzim aktivitesinin logaritmasını (y ekseni bağımlı değişken) oluşturur (yani, bir bağımsız değişken, Şekil 5a-c). Aktivasyon enerjisi genel olarak bir kimyasal reaksiyon (yani, daha küçük bir ürün halinde, belirli bir alt-tabaka indirgeme) katalize için gereken en düşük enerji olarak tanımlanır. Bizim amaçlarımız için, aktivasyon enerjisi enzim katalize reaksiyonların sıcaklık duyarlılığı için bir vekil olarak hizmet vermektedir. Daha yüksek bir enzim aktivasyon enerjisi ısı hassasiyeti gösterir. Aynı şekilde, aktivasyon enerjisi (örneğin, Şekil 5d-f) Q, doğrudan 10 değerleri (yani Şekil 6a-c) karşılık gelir. Aktivasyon enerjisi ve pratik uygulama hesaplamak için kullanılan formüllerin bir başka açıklama, geçmişte çok sayıda bulunabilir 40,43-45 çalışır. Arrhenius araziler, aktivasyon enerjisi ve Q 10 araziler gereksiz bilgi ve olmamalıdır sağlamakTüm yayın için verileri sunmak için, aynı metin içinde kullanılabilir (Şekil 5 ve 6). Kinetik verileri 10 – Bu teknikleri kullanarak, bu nedenle, bu enzim sıcaklığı için en uygun arsa türünü seçmek gerekir. Tüm arsa türleri (Arrhenius ve Q 10) gösteri amaçlı burada sunuldu; enzim sonuçlarını sunmak için nasıl görsel örneklerini sağlamak. Bizim örneklerde, potansiyel C-, N-ve iki derinliklerde toprak parselleri, her iki tedavi arasında P-EEAS potansiyel enzim kinetiği değerlendirildi (Şekil 5, Şekil 6). Bulgu EEAS sıcaklık hassasiyeti Arrhenius parsellerin (Şekil 5a-c) ve ilgili aktivasyon enerjileri (Şekil df) ve (doğal olarak) Q için gösterdiği gibi aktivasyon enerjisi için toprak derinliklerinde ya da tedavi araziler arasında anlamlı farklılık olduğunu gösterdi 10 FKÖ(, Şekil 6a-c, 15 ° C ve 25 ° C laboratuar inkubasyon arasındaki bu örnekte) ts. Bu enzim kinetiği bu özel çalışmada alan deneysel tedavilerin etkisi olmadığını göstermektedir. Tablo 1. Önce kuluçka için derin kuyu plaka içine toprak örnekleri ile organize ve yükleme floresan standartları (MUB veya MUC) için toprak örnekleri ile floresan standart konsantrasyonları için derin kuyu plaka tasarımı. Şablon. Not: sütunlar aynı toprak örnekleri (toprak çamur eklemeler 800 ul) temsil eder. Floresan standart konsantrasyonların gradyanı her satır (200 ul etme) için yüklenir. Her hücre floresan standart konsantrasyonu artı toprak çamuru eklemeler temsil eder. Örneğin, S1 – S12 toprak örnekleri (toprak bulamaç 800 ul) temsil eder; MUB 0-100 mcM = 4-Methylumbelliferone konsantrasyonları (200 ul ilave). Bu örnekte, sıra H açık olan ve gerekirse daha yüksek bir konsantrasyonu standart bir floresan eklemek için sonuç olarak kullanılabilir. Standart eğri konsantrasyonlarını arttırmak için bu karar, belirli toprak örnekleri için daha fazla potansiyel enzim aktivitesi (ve / veya kullanılan substrat konsantrasyonu) için gerekli olabilir. Numune için potansiyel enzim aktivitesi standart eğri değerler aralığında olmalıdır. daha büyük bir tablo görmek için buraya tıklayın . Tablo 2. Organize ve önceden kuluçkaya için derin plaka içine toprak örnekleri ve alt tabakaları yüklerken için substrat. Şablon ile toprak örnekleri için derin kuyu plaka tasarımı. Not: sütunlar aynı toprak örnekleri (yani 800 ul temsilil bulamacı ilave). Farklı yüzeyler (200 ul eklemeler) Her satıra yüklenir. Her hücre toprak örnekleri artı tabaka ek temsil eder. Örneğin, S1 – S12 benzersiz toprak örnekleri (toprak bulamaç 800 ul) temsil eder. Dayanaklar (200 ul ilave) şunları içerir: BG = 4-Metilumbelliferil β-D-glukopiranosid; CB = 4-Metilumbelliferil β-D-sellobiyosid, NAG 4-Metilumbelliferil N-asetil-β-D-glükozaminit =; PHOS = 4-Metilumbelliferil fosfat: XYL = 4-Metilumbelliferil-β-D-ksilopiranozit olmasıdır; AG = 4-Metilumbelliferil α-D-glukopiranosid ve LAP = L-Lösin-7-amido-4-metilkumarin hidroklorür. Bu örnekte, satır H açık olduğunu ve istenirse başka bir potansiyel enzim aktivitesini değerlendirmek için başka bir madde içerir sonuç olarak kullanılabilir. daha büyük bir tablo görmek için buraya tıklayın . Sıcaklık Zaman 4 ° C ~ 23 saat 15 ° C 6 saat 25 ° C 3 saat 35 ° C 1.5 saat Tablo 3. Kuluçka sıcaklıkları inkübasyon süresi ilgili dönemlere için gereklidir. Kuluçka sıcaklıkları ve enzim tahlili işlem için ilgili süreler. Tablo 4. MUB ve MUC standart eğri hesaplamaları. Düzenlemek için nasıl gösterir a) MUB ve b) MUC ham florasan veri (ľmol) sonradan eğim, y-kesişim, ve R-kare değerlerini hesaplamak için. , Standart konsantrasyon eğrisinin eğimi, y-kesişim, ve R-kare değerlerini hesaplamak seçmek için (veya arsa)MUB ve / veya bağımsız değişken (x-ekseni) halinde bağımlı değişken (y-ekseni) ve standart bir konsantrasyonu (umol) halinde ham MUC floresan verileri. Not:. MUB = 4-metilumbeliferon; MUC = 7-Amino-4-metilkumarin büyük tablosunu görmek için buraya tıklayın . Tablo 5. . Ľmol faaliyet / g kuru toprak / saat: Enzim aktivite hesaplamaları) örnek ham floresan verileri düzenlemek ve sonradan içine EEAS hesaplamak için (bf) gerekli adımları gerçekleştirmek için nasıl gösterir. Not: S1 – S12 benzersiz toprak örnekleri temsil eder. Elyaf şunlardır: BG = 4-Metilumbelliferil β-D-glukopiranosid; CB = 4-Metilumbelliferil β-D-sellobiyosid, NAG 4-Metilumbelliferil N-asetil-β-D-glükozaminit =; PHOS = 4-Metilumbelliferil phosphate: XYL = 4-Metilumbelliferil-β-D-ksilopiranosid; AG = 4-Metilumbelliferil α-D-glukopiranosid ve LAP = L-Lösin-7-amido-4-metilkumarin hidroklorür. daha büyük bir tablo görmek için buraya tıklayın . Şekil 1. Bağımsız değişken (x-ekseni) olarak bağımlı değişken (y-ekseni) ve standart konsantrasyonu (mmol) olarak çiğ floresan veri ile standart eğriler MUB standart eğri arsa. Saçılım görselleştirme. Şekil 2. C, N ve P bisiklet enzim aktiviteleri. Prairie Isıtma ve Yükseltilmiş CO 2 En'de Potansiyel EEASkontrol parsellerde richment (PHACE) sitesi (ACN: çevre, iklim koşullarına maruz kalan) ve tedavi araziler (EHN: artan sıcaklık ve yüksek CO maruz 2). Toprak enzimler) 0-5 cm toprak derinliklerinde ve b) 5-15 cm toprak derinliklerinde tahlil edildi. Dikey çubuklar ± SE Not ortalaması temsil: ACN = ortam – İklim araziler; EHN = yüksek CO 2 ve ısıtma araziler. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 3,. Toplam C, N ve P bisiklet stokiyometrik oranları enzim a) C, b) N toplama dahil potansiyel EEAS toplamını, ve c) PHACE deneyde her iki tedavi grubu P-için 0-5 cm ve 5 de. – 15 cm toprak derinlikleri. Vertical barlar ± SE Not ortalaması temsil: ACN = ortam – İklim araziler; EHN = yüksek CO 2 ve ısıtma araziler. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 4. (: İklim koşullarına maruz ACN) ve tedavi araziler (EHN. Toplam C, N, P ve bisiklet enzim aktiviteleri Prairie Isıtma ve Yükseltilmiş CO 2 Zenginleştirme kontrol parsellerinde (PHACE) sitesi de Enzim satın alma aktivitesi stokiyometrik oranlar için Enzim stoikiyometri: yüksek sıcaklığa maruz kalan ve yüksek CO2). Toplam toprak a) C: N, b) C: P ve c) N: P 0-5 cm ve 5-15 cm toprak derinliklerde iki tedavi grubu için çizilmiştir. Dikey çubuklar ortalama ± SE Not temsil: ACN= Ortam – İklim araziler; EHN = yüksek CO 2 ve ısıtma araziler. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 5,. . ° C) hem de total d karşılık gelen aktivasyon enerjisi değeri, potansiyel EEAS toplam C, N ve P bisiklet enzim aktivasyon enerjileri sıcaklık duyarlılığı, toplam a) C, b) N Arrhenius eğrileri kullanılarak, ve c) P bozundurucu enzimler gösterildi: , e) N, ve f) P Prairie Isıtma ve Yükseltilmiş CO 2 Zenginleştirme (PHACE) sitesi de tedavi araziler ve toprak derinliği arasında parçalayıcı enzimler. ACN = a: aktivasyon enerjisi (yani df) Dikey çubuklar ± SE Not ortalaması temsilmbient – İklim araziler; EHN = yüksek CO 2 ve ısıtma araziler. Yayın için, yazar, tipik Arrhenius araziler (yani AC) ya da aktivasyon enerji değerleri (yani df), ancak her ikisi de arsa-türlerini ibraz seçsin dikkat etmek önemlidir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 6,. Toplam C, N ve P bisiklet enzim Q10 (15-25 ° C). Sıcaklığı, toplam a) C, b) N için 15 ° C ve 25 ° C 'de inkubasyon laboratuar göre Q 10 olarak ölçülmüştür potansiyel EEAS, duyarlılıkları ve c) P Prairie Isıtma ve Yükseltilmiş CO 2 <de tedavi araziler ve toprak derinliği arasında parçalayıcı enzimler/ Sub> Zenginleştirme (PHACE) sitesi. Q10 dikey çubuklar ± SE Not ortalaması temsil: ACN = ortam – İklim araziler; EHN = yüksek CO 2 ve ısıtma araziler. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Potansiyel toprak EEAS laboratuvar tabanlı ölçüm ekosistem işleyişi için önemli abiyotik çevreye mikrobiyal yanıtları içine anlayışlar ve bunların sonuçlarını sağlayabilir. Bu örnekte, veri kümesinin sonuçları minimal bir fark iklim tedavi araziler arasında kir enzim aktivitesi veya kinetik var olduğunu göstermektedir. Ancak, araziler arasında ters eğilimler, toprak nemi, toprak pH veya bitki büyümesi gibi mikrobiyal EEAS üretimini etkileyebilecek değişkenlerin daha fazla araştırma teşvik ediyoruz. Genel olarak, topraklarda (1) genel EEA, (2) EEA stoikiometride (3) Arrhenius araziler / aktivasyon enerjisi, ve (4) Q 10 ekosistem düzeyinde süreçlerin göstergesi olabilir yaklaşımların geniş bir spektrum sağlar açısından EEAS değerlendirilmesi sağlam toprak ekosistem fonksiyonel dinamiğini karakterize etmek için hangi.

Yüksek verim flüoresan bazlı deneyler, EEA yaygın topraklarda potansiyel EEAS incelemek için kullanılan ve yararlı bir araçtırdiğer ortamlar. Önemlisi, potansiyel aktiviteler enzim havuzu boyutunu yansıtmaktadır, ancak kendileri tarafından enzim üretimi veya ciro oranlarını 46 ölçmek değil. Tekniği oldukça basit olsa da, laboratuvar protokolleri arasında görünüşte küçük farklılıklar sonuçlarının 13 karşılaştırılabilir engelleyebilir. Ne yazık ki, şu anda EEAS için uygun standart pozitif kontrolleri yok. Stokiyometrik oranların kullanımı bu zorlukların üstesinden gelmek için, bir yaklaşımdır. Aksi takdirde, yüksek verimli teknikleri gelişiyle ortamında 4 enzimlerin çalışma ilerlemiştir. Bu tahliller tarafından üretilen verinin dikkatli yorumlanması mikrobiyal aktiviteye önemli eğilimleri izah edebilir.

Protokolün sağlamlığı bireysel örnekler özel koşullar seçmek için ileri gelmektedir, ancak bu da bir sınırlama neden olabilir. Modifikasyonları bir dizi örnekleri doğru olarak ölçülür sağlamak için gerekli olacaktır Ayrı alan siteler:

Tampon

Seçtiğiniz tampon toprağın pH değerine bağlı olacaktır. Tamponlama da 27,47 yüksek pH bağımlı olan floresan standartların floresan yoğunluğu, stabilize eder. Örnek pH seviyeleri – Normal olarak, topraklı çamurun yapmak için kullanılan tampon, pH en iyi eşleşme toprağa tamponunun, özellikle asit ayrışma sabiti (pKa) için seçilmiş olan bir 50 mM sodyum asetat, Tris tamponudur. Sodyum asetat 4,76 arasında bir pKa'ya sahiptir ve Tris 8,06 bir pKa değerine sahiptir, bu nedenle, bu iki tampon miktarları, ayrı ayrı örnek için istenen pKa değerine ulaşmak için değişecektir. Fosfat tamponu (pKa = 7.2) nötr / hafif bazik topraklar için önerilmiştir. Ancak, yüksek fosfat konsantrasyonları enzim aktivitesi ile müdahale olabilir, bu tampon kullanmadan önce ön çalışmalarda analitik değişkenlik test etmek için dikkatli olun.

Floresan yüzeylerde Taşıma ve depolama

jove_content "> Flüoresan tahliller ışığa maruz kaldığında kirlilikler ve / veya birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir, bu nedenle floresan tabakaları kullanırken dikkatli olunmalıdır. Önemle floresan substratları ve Mub ve MUC standartlarını etiketli için herhangi bir ışık maruziyeti en aza indirilmesi tavsiye . amber cam şişe kullanılması veya floresan substratları ve standartları yapmak ve saklamak için kullanılan cam ve kapları kapsayan önerilen; cam ve kapları sarmak için alüminyum folyo iyi çalışıyor Aynı şekilde, verimli bir tabak aşılanması ve karanlık inkübatörlere aktarılması en iyi uygulamadır. öneririz. (-20 ° C) için artık iki aydan (ışık onları korurken) substratları ve standartları depolanması ve çözülme yüzeyler (5 ° C) ~ öncesinde enzim tahlili (ler) başlamadan 24-48 saat.

Tasarım ve Çoğaltma

Iyi iyi örnek varyasyonları, negativ uygulanması için en iyi hesape tahlil kontrolleri ve tahlil çoğaltır (eğer mümkünse) önerilir. Varyasyon tipik olarak her bir oyuğa toprak parçacıklarının miktarı farklılıklar ve pipetleme hataları oluşur. Bu nedenle, güçlü karıştırma ve iyi pipetleme tekniği ölçüde iyi varyasyon iyi en aza indirecektir. Ayrıca, biz şiddetle zamanla yüzey tutarsızlıkları izlemek için negatif bir tahlil denetimi (tampon + substrat çözeltisi) uygulanması öneririz. (Normal olarak, 96-yuvalı plakalar üzerinde son sütunu kullanımı) negatif kontrol kuyuları karşılaştırarak enzim plakaları okurken bu kolayca izlenebilir. Negatif kontroller substrat bu nedenle de saptama sınırının üzerinde sinyal artar, bu alt-tabaka ve / veya standart çözeltilerin değiştirilmesini gerektiren kirlenme ya da alt-tabaka istikrarsızlık göstergesidir, tipik olarak stabildir.

Diğer protokolleri bir tür gerçekleştirin rağmen verimi maksimize etmek için, bizim protokol, tek bir derin kuyu mikrotablada birkaç potansiyel EEAS içerirFarklı EEAS beri plaka (plaka başına yani bir alt tabaka) başına deney farklı hızlarda meydana gelir. Ne olursa olsun, enzim optimizasyonu yaklaşım ya da tek plaka yaklaşımı boyunca yüksek bu gerçekleştirmeden önce topraklar üzerinde yapılmalıdır. Reaksiyon hızları İnkübasyonun süre içinde, her bir enzim için nispeten tutarlı, birden çok alt-tabakalar, tek bir plaka üzerinde kullanılabilir.

~ 1 gram diğer protokoller 24 tavsiye edilirken Bizim protokol, ~ bulamaç, çözelti elde etmek için 2.75 g toprak önerir. Biz daha fazla toprak (eğer mümkünse) kullanarak içinde-örnek enzim aktivite düzeyleri toprak değişimi iyi yakalamak için etkili bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Diğerleri sadece alt-tabakalar, 50 ul toprak çamurunun 200 ul inkübe edilir ise, bu protokolde, 200 ul substrat ile toprak çamurunun 800 ul inkübe edin. Bu sadece en sonunda ölçülen aktivitesi değişmez ölçekleme bir fonksiyonudur. Pratik avantajları da vardırDaha büyük hacimli kullanmak için. Bir, florometre üzerinde yoğunluklarına kayıt işleminden önce siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar karşılık gelen pipetleme ise toprak partikülleri önlemek için daha kolaydır. Enzim ile ilgili floresan şiddetleri kayıttan önce florometre için siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar aktarımı İkinci olarak, ek bir hacim kazara dökülmesi durumunda yararlıdır. Hacim bile küçük sapmalar önemli ölçüde kuyuların arasında floresan azalacaktır. Son olarak, bu nedeniyle protokolün yüksek kapasiteli yapısı nedeniyle, genellikle oldukça tahlil çoğaltır gerçekleştirerek daha enzim aktivite düzeyleri değişimi temsil etmek deneysel çoğaltma güvenmek seçerler. Her zaman analitik çoğaltır dahil etmek iyi bir uygulamadır, ama pratikte, bizim protokol sınırlı kaynaklar göz önüne alındığında, analitik ve deneysel suretin arasında dengeli bir dengeyi sağlar hissediyorum. Aynı şekilde, bizim yaklaşımımız doğasında olan, tahlil başına 25 görece daha iyi homojenize toprak (2.75 g) kullanırntly içi toprak varyasyonları azalır. Analitik çoğaltır kullanmak için karar dikkatle ön çalışmalarda 48 analitik hata için test tarafından kabul edilmelidir. Ancak, biz az 4 tedavi grubu çoğaltır deneysel tasarımlar güçlü deneyi çoğaltır kullanarak düşünmelisiniz öneririz.

Toprak, Tampon Ciltler ve Substrat konsantrasyonu optimizasyonu

Toprak tamponu: alt tabaka konsantrasyonu oranı, enzim tahlilleri gerçekleştirirken güçlü ölçülen floresan etkileyen önemli bir değişkendir. Bulamacın toprak miktarı tahlil ya da alt-tabaka konsantrasyonunun, bir toprak numunesi için enzim aktivitesine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ilave edildi. Bu örnek için seçilen miktarları için alt-tabaka elverişliliğini deney koşulları (V max) altındaki maksimum potansiyel oranlarının ölçümü olduğu sınırlandırıcı olmayan, ve daha emin olmak için bu toprakların önceki test dayanmaktadır 44,45. Bununla birlikte, enzimlerin yüksek konsantrasyonlarda toprak örnekleri için, toprak ya da alt-tabaka konsantrasyonunun miktarı artırılmalıdır. Bu alt-tabaka, artan konsantrasyonlarda (ve buna uygun olarak standart eğri ayarlama) eğrinin lineer etkileyebilir bulduk. Bu nedenle, gerekli hacimleri tampon toprak miktarları ve / veya oransal ayarlamaları azaltılması önerilir. Ne olursa olsun, ölçülen EEAS doymuş ve alt doymuş substrat konsantrasyonları 26 arasında daha fazla bir büyüklük sırasına göre değişiklik olabilir, çünkü tahlil her toprak türü için substrat konsantrasyonu optimize etmek için önemlidir. Bu nedenle deneysel tedaviler (vb) arasındaki farklar tip II istatistiksel hata ve alt-doyurarak koşullarda tespit edilecek daha az olasıdır ve istatistiksel hata 27,35 duyarlıdır. Alt tabaka konsantrasyonları uygun hale getirmek için, ön enzim tahlilleri alt-tabaka konsantrasyonları geniş bir yelpazede kullanarak temsili toprak numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir gerekir. Sonrafloresan kayıt, sadece (benzer şekilde, standart eğri örnek, Şekil 1) veri arsa aktivitesi (y-ekseni) enzim karşılık gelen alt-tabaka konsantrasyonu (x-ekseni) tanımlamak için burada eğim seviyesi kapalı (0 ~). Aynı şekilde, eğim seviyesi kapalı (~ 0) o toprak için uygun alt-tabaka konsantrasyonunun bir göstergesi olduğunu noktasına karşılık gelen alt-tabaka konsantrasyonu.

Bu deney, sonuçta enzim aracılı substrat depolimerizasyon bir sonucu olarak alt-tabaka yarılır flüorojenik kısmı tarafından üretilen belirli bir zaman içinde floresan ölçer. Bu nedenle, aşama 5 (alt-tabaka ekleme) kritiktir ve alt tabaka kirlerin eklendiğinde ve deneyler enkübe edildiği zaman arasındaki süreyi en aza indirmek için mümkün olduğu kadar etkin gerçekleştirilmelidir. Alt-tabaka, numune ile temas bir kez benzer şekilde, enzimatik reaksiyonlar meydana başlayacaktır. Biz bir çok kanalı kullanarak tavsiyeBu nedenle pipetle. Kuvvetle önce gün size enzim tahlilleri performans çok kanallı pipet kullanarak verimli olmak için önerilmektedir. Kolayca pipet ile 96-kuyu tabak içine birimleri aktarmak kadar bu başarmak için, su ile pipetlenmesini pratik yapabilirsiniz.

Toprak Islah

Su ile soğutma, toprak bulamaçlar-inkubasyon 26 parçacık ve / veya organik madde tarafından neden olunan floresan yoğunluğunun azaltılması anlamına gelir. Tampon oranları 25: söndürme toprak ayarlayarak etkilenmiş olabilir. Nedeniyle tek örneklerinden eşiğe için, bu arka plan (söndürme) floresan için hesap numuneleri ile standartları çalıştırmak için çok önemlidir. Bazı protokoller, sinyal doğrusal olduğu test edildikten sonra, tek bir konsantrasyonda kullanımı olsa da, şiddetle su verme etkilerinden en iyi kontrolü için her bir örnek için standart soğutma kontrol uygulanması önerilir. Aksi takdirde bir stand neden olacaktırörnek için geçerli değildir ard eğrisi ve enzimatik aktivite, yanlış bir kestirimi. Standart ekleme numunenin floresan arka plan etkilemez gibi kir bulamaçlara standartların eklenmesi, zamana duyarlı değildir.

NaOH ilavesi

NaOH ilavesi, sentetik alt tabakalardan salınan fluoresan boya> pH 9.0 26,49 floresan tepe sergileyen için florimetrik enzim etkinlik ölçümleri optimize etmek için bir protokol kullanılır. Bu öneri göz önüne alındığında, toprak çamuru pH değerinde (örneğin pH> 9) için gerekli olan NaOH konsantrasyonu belirli toprağa bağlı olarak değişir ve pH, tampon 26 kullanılır. Ancak, diğerleri sinyal yoğunluğu daha düşük pH değeri genellikle çok yüksektir, çünkü bu ölçüm hatası ek bir kaynak sunuyor çünkü NaOH gerekli olmayabilir savunuyorlar. Örneğin, çamur pH ve böylece MUB veya MUC fluore üzerinde NaOH ilavelerin etkisizaman üzerinde 25 scence değişir. Kadar 60 dakika boyunca 26 floresan azalma MUC sabit göstermiştir etmektedir; MUB bağlanmış alt-tabakalar seviyeleri koniklik önce NaOH ekleme takip eden 20 dakika boyunca sürekli artan flüoresans göstermek için gösterilmiştir. Bu nedenle, NaOH ilavesi ve floresan ölçümü arasındaki süre, standardize etmek önemlidir. Floresan seviyeleri NaOH eklemeden tahliller yapmak, eklenmeden yeterince tespit edilebilir, alternatif olarak, aynı şekilde kabul edilebilir bir alternatif olarak 26 önerilmiştir.

Sıcaklık

Inkübasyon sıcaklığı karar verirken sıcaklık duyarlılığı göz önüne alınmalıdır. Birincil ilgi gösterildiği gibi (sonuç bölümünde) Arrhenius araziler kullanarak üç veya daha fazla sıcaklıklar kullanılarak, enzim kinetiği anlayış ise sağlam bir yaklaşımdır. Örnek site gibi sonra buzlanma toprak, duratio karakteristik olarak düşük sıcaklık varsainkübasyon n soğuk inkübasyon sıcaklıklarda tepkimeye enzimler için izin vermek için uzatılabilir gerekebilir. Geleneksel enzim kinetiği sıcaklığındaki bir artış, enzim aktivitesi ile sonuçlanmalıdır göstermektedir birlikte, enzimler, sıcaklık 50 duyarlılık açısından belirli bir site olabileceğini bulduk. Bu nedenle alana özgü enzim aktivitesi potansiyelini anlamak için bu inkübasyon sıcaklığı ve süresi alan yeri değerlerini yansıtacak şekilde ayarlanması önemlidir.

Sonuç

EES topraklarda biyokimyasal süreçlerin kritik sürücüleri, ve böylece biz onların faaliyetlerini ölçmek gerekiyor. Girişim ve engellenmesi dahil topraklarda EEAS, ölçüm için pek çok zorlukları vardır. Bu zorluklara rağmen, (burada tarif edilen gibi) standart protokolleri evrensel enzimleri geniş bir yelpazede EEAS ölçülmesi için tatbik edilebilir. O, bu protokoller aşağıdaki kalite verilerini oluşturmak oldukça kolay olsaekolojik bağlamda bu rakamların tef si bu tahlilleri gerçekten ölçüm şeyin dikkatli bir değerlendirme gerektirir ve nasıl tahlil koşulları altında EEAS yerinde koşulları altında farklı olabilir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayın ABD Ulusal Bilim Vakfı (DEB # 1021559) tarafından desteklenen Çevre Araştırma Koordinasyon Ağı Araştırma Enzimler tarafından finanse edildi. Bu araştırma ABD Ulusal Bilim Vakfı (DEB # 1021559) ve Bilim Enerji Dairesi (Biyolojik ve Çevresel Araştırma) ABD tarafından desteklenmiştir. Bu malzemenin ifade herhangi bir görüş, bulgular ve sonuçlar ve öneriler yazarların aittir ve ABD NSF görüşlerini yansıtmaz.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalogue number Comments
Reagents:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) Sigma Aldrich M9766 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) Sigma Aldrich M3633 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) Sigma Aldrich M6018 Cellulose degradation
L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) Sigma Aldrich L2145 Protein degradation
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) Sigma Aldrich M2133 Chitin degradation
4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) Sigma Aldrich M8883 Phosphorus mineralization
4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) Sigma Aldrich M7008 Hemicellulose degradation
4-Methylumbelliferone (MUB) Sigma Aldrich M1381
7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) Sigma Aldrich A9891
50 mM Sodium acetate anhydrous buffer Fisher Scientific S210-500 acidic and neutral soils
50 mM Tris base buffer Fisher Scientific BP154-1 basic soils
Equipment
Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs Fisher Scientific 14-512-65 pipetting reservoir
Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel Fisher Scientific 13-684-265 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl
TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips USA Scientific 1112 – 1720 10 racks of 96 tips (960 tips)
Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. Fisher Scientific 11-100-100SH Lab disc magnetic stir plate
Waring blender Fisher Scientific 14-509-7P Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container
BRAND Dispensette III bottle-top dispensers Fisher Scientific 13-688-231 Dispenser; range: 5-50 ml
Wheaton Unispense μP peristaltic pumps Fisher Scientific 13-683-7 Optional dispenser
Fisherbrand magnetic stir bar Fisher Scientific 1451363SIX Used to stirr soil slurry afer blending
Pyrex glass bowls World Kitchen 5304218 Pyrex 10 oz rimmed custard cup
Costar 96-well black solid plates Fisher Scientific 07-200-590 Used for plate reader step
Costar 96-well assay blocks Fisher Scientific 07-200-700 V-bottom; 2 ml; sterile
Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats Fisher Scientific 14-387-93 Sterile 96-well cap mat for square wells
Centrifuge equipped with holders for deep-well plates Thermo Scientific 3121 Centra-GP8 (this model is no longer available)
Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader Tecan 30016058 Plate reader (this model is no longer available)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Burns, R. G., Dick, R. P. . Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O., Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. . Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. , (1999).
  15. Tabatabai, M. A., Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. . Methods of Soil Analysis. 2, 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER – MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151 (2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P., Shukla, G., Varma, A. . Soil Biology. 22, 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis – Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J., Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. , 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279 (1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79 (1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

Tags

Soil Extracellular Enzyme ActivitiesFluorometric MeasurementSoil Microbial Enzyme ActivityFluorescence Enzyme AssaySoil SlurriesFluorescently Labeled SubstratesPotential Enzyme ActivitySoil Ecosystem Functional DynamicsEnzyme Kinetics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca, J. D., Steinweg, J. M., McMahon, S. K., Wallenstein, M. D. High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities. J. Vis. Exp. (81), e50961, doi:10.3791/50961 (2013).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image