Tecnología de Inserción Metamórfica temprana para insectos de vuelo Supervisión del comportamiento
Summary
We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.
Abstract
Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.
Introduction
Insertando electrodos, incluso con sistemas electrónicos conectados a los insectos para aplicaciones de grabación de telemetría, ha sido un método importante para entender cómo funcionan los sistemas neuronales durante el vuelo naturales 1. Colocación o la implantación de sistemas artificiales en los insectos ha planteado muchos desafíos relacionados con el potencial para perturbar el vuelo natural de insecto. Apego superficial o la inserción quirúrgica de plataformas artificiales en el insecto adulto es poco fiable debido a la posible desplazamiento de los dispositivos insertados causadas por la inercia y el estrés inducido por las fuerzas del cuerpo-. Superficialmente unidos o electrodos insertados quirúrgicamente también son propensos a ser rechazado por los insectos como un cuerpo extraño. Además, la operación de implantación requiere la eliminación de las escamas y las pilas en todo el exoesqueleto. La capa de la cutícula gruesa también necesita ser penetrado por inervaciones quirúrgicos que pudieran causar daños colaterales al tejido, lo que interfiere con el vuelo natural de los insectos. Todos los tstos factores pueden hacer que una operación de implante quirúrgico o superficial una tarea difícil y delicada. Con el fin de resolver estos problemas implicados en la unión de los sistemas de control externo y de detección para los insectos, una metodología novedosa que implica el crecimiento metamórfico se describe en este artículo.
El desarrollo metamórfico de insectos holometabolic comienza con la transformación de la larva (o ninfa) en un adulto con una fase de pupa intermedio (Figura 1). El proceso de la metamorfosis implica una extensa reprogramación tejido incluyendo la degeneración seguido de remodelación. Esta transformación se vuelve una larva terrestre a un insecto adulto que demuestra varios comportamientos complejos 2,3.
La supervivencia de los insectos después de cirugías parabiotic extremas se ha demostrado donde se realizaron las cirugías durante las primeras etapas metamórficas 4,5. En estas cirugías, las caus histogénesis de desarrolloheridas quirúrgicas ed para ser reparado en duraciones más cortas. Siguiendo estas observaciones, una nueva técnica ha sido desarrollada donde se realizó la implantación de electrodos conductores de la electricidad durante las primeras etapas de crecimiento metamórfica (Figura 1). Esto permite una fijación biomecánicamente segura en el insecto 6. Una interfaz altamente fiable también se asegura con neuronal del insecto y sistemas neuromusculares 7. Esta técnica es conocida como "La tecnología de inserción temprana Metamorfosis" (MACI) 8.
Después de la reconstrucción de todo el sistema de tejidos, estructuras insertados en la pupa surgen con el insecto adulto. Grupos de músculos de vuelo hacen hasta un 65% de la masa corporal total y torácica, por lo tanto, es un objetivo relativamente conveniente para el procedimiento EMIT 9. Durante el batir de las alas de base, los cambios en la morfología del vuelo alimentar dorsolongitudinal (dl) y el dorsoventral (DV) músculos hacen que el ala Articulatgeometría ion para generar la elevación 10. Por lo tanto la coordinación funcional de los músculos dl y DV ha sido un tema de investigación activa en virtud de la neurofisiología de vuelo. Insectos Tethering en entornos visuales programados electrónicamente ha sido el método más común para el estudio de la neurofisiología de los comportamientos locomotores complejas 11,12. Arenas cilíndricas compuestas de paneles de diodos emisores de luz han sido utilizados para estos entornos de realidad virtual, donde los insectos voladores son atados en el medio y el movimiento se simula mediante la actualización dinámica de la pantalla de visualización panorámica de los alrededores. En el caso de los insectos más pequeños, tales como mosca de la fruta Drosophila, la inmovilización se logra mediante la fijación de un pasador metálico en el tórax dorsal de la insectos y colocar el pasador en virtud de un imán permanente 13,14. Este método sólo permite la cuantificación de las respuestas motoras a través de observaciones visuales con cámaras de alta velocidad sin ningún análisis electrofisiológico. Por otra parte, esta metod ha sido ineficiente para suspender el cuerpo más grande y más pesado de Manduca sexta. Para resolver este problema, nos beneficiamos de los marcos de levitación magnética, donde Marcos peso ligero con imanes unidos a su parte inferior levitan mediante fuerzas electromagnéticas. Cuando se combina con amplificadores neuronales disponibles en el mercado y las matrices de LED, lo que proporciona una plataforma para controlar la salida del vuelo con motor y registrar la electrofisiología relacionados de Manduca sexta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos durante la inserción quirúrgica de los electrodos de registro que afectan a la capacidad de grabar datos en los pasos posteriores del protocolo. Los electrodos de registro se deben insertar en la pupa un día después de que exhibe manchas del ala en su lado dorsal. Si la inserción se realiza dos o más días después de este tiempo, el tejido del insecto no tendrá tiempo suficiente para desarrollar y estabilizar alrededor de los electrodos insertados. Esto podría dar lugar al movimiento …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AB agradece la Fundación Nacional de Ciencia para la financiación con arreglo al programa de Cyber sistemas físicos (1239243) y la División de Educación de Pregrado (1245680); y la Agencia de Defensa de Investigación Avanzada de Proyectos (DARPA) para soportar las primeras etapas de este trabajo. Las primeras etapas de este trabajo fue realizado por AB en el laboratorio del Prof. Amit Lal en la Universidad de Cornell. AB gracias Ayesa Sinha y el Prof. Lal orientación experimental y la generación de ideas en esa etapa. Manduca sexta (Linnaeus 1763) se obtuvieron de una colonia mantenida por el Departamento de Biología de la Universidad de Duke, Durham, Carolina del Norte, EE.UU.. Las polillas se utilizaron dentro de los 5 días de la eclosión. Nos gustaría dar las gracias al Triángulo Biosystems Internacional, especialmente David Juranas y Katy Millay por su excelente asistencia técnica y el uso de su sistema Neuroware. También nos gustaría dar las gracias a Will Caffey por su ayuda durante los experimentos.
Materials
| Coated stainless steel wire | A-M Systems | 791900 | 0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed |
| Flexible electrode wire | Litz or inductor wire can be used. | ||
| Surface-mount FFC connector | Hirose Connector | FH28E-20S-0.5SH(05) | |
| Tweezers | Grobet USA | N/A | Clean with 70% alcohol before use on the insect. |
| Kim-Wipes | Kimberly-Clark Worldwide | 34155 | Any size delicate-wipe tissues can be used. |
| Teflon tape | N/A | N/A | 5 mm width Teflon tape. |
| Hypodermic Needle | Becton Dickinson & Co. | 30511 | 20-30 gauge hypodermic needle can be used. Video showed 30 gauge. |
| Rigid Fixation Stick | N/A | N/A | Variety of materials can be used (e.g. coffee stirrers) |
| Insect Emergence Cage | N/A | N/A | Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed. |
| Thermal Cauterizer | Advanced Meditech International | CH-HI CT2103 (tip) | Optional equipment used for application of dental wax. |
| Dental Wax | Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma | N/A | Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect. |
| Magnetic Levitation Platform | N/A | N/A | Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping |
| CA40 Instant Adhesive | 3M | 62-3803-0330-5 | Avoid skin contact. Use gloves when handling. |
| 70% Isopropyl alcohol | store brand | Commercially available from many suppliers. | |
| PCB Etchant | RadioShack | 276-1535 | Toxic if swallowed or ingested, skin irritant |
| EQUIPMENT: | |||
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| TBSI Neuroware Software | Triangle Biosystems International | N/A | NeuroWare v1.4. Software for importing .nex files obtained at Technologies, N. NeuroExplorer Code and Scripts. (2012).at http://www.neuroexplorer.com/code.html |
| TBSI Wireless Recording System | Triangle Biosystems International | W5 FI | USB Base station, headstage unit, charger |
| 16 Channel Amplifier A-C Amplifier | A-M Systems | 950000 | Model 3500 (110 V) |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DSO1014A | Oscilloscope, 100 MHz, 4 channel |
| Microscope | N/A | N/A | 5x magnification microscope to assist visualization during electronics construction. |
| Ultrasonic Cleaner | ColeParmer | EW-08848-10 | Ultrasonic Cleaner with Timer, |
Referencias
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