Двухфотонное Кальций изображений на мышах навигации среда виртуальной реальности
Summary
Здесь мы опишем экспериментальные процедуры, связанные с двухфотонного визуализации мыши коры во время поведения в виртуальной среде реальность.
Abstract
В последние годы изображений двухфотонного стал бесценным инструментом в области неврологии, так как он позволяет хронической измерения активности генетически определенных клеток в процессе поведения 1-6. Здесь мы опишем методы для выполнения визуализации двухфотонного в мыши коры, пока животное переходит виртуальную среду реальность. Мы ориентируемся на аспектах экспериментальных процедур, которые являются ключевыми для визуализации в ведет себя животное в ярко освещенном виртуальной среде. Ключевые проблемы, которые возникают в этой экспериментальной установки, что мы здесь адрес являются: минимизация движения, связанные артефакты мозга, минимизируя проникновение света от системы виртуальной реальности проекции, и сведение к минимуму лазерный индуцированного повреждения тканей. Мы также предоставляем образец программного обеспечения для управления виртуальной средой реальность и сделать отслеживание зрачка. С помощью этих процедур и ресурсов должно быть возможно преобразовать обычный двухфотонного микроскопа для использования в себя мышей.
Introduction
Двухфотонное визуализации показателей кальция (генетически закодированных как GCaMP5 7 или R-GECO 8 или синтетических красителей, как НГБ или Fluo4) стала мощным методом измерения нейронной активности в себя мышам 1-6. Это позволяет одновременное измерение активности сотен клеток в почти один потенциала действия разрешения, до примерно 800 мкм ниже поверхности мозга 9,10. Кроме того, использование генетически кодируемых показателей кальция (GECIs) нейронную активность может быть измерена хронически 5,11,12, и в генетически определенных типов клеток 13. Вместе эти методы обеспечивают степень временным и пространственным разрешением, что открыть множество новых возможностей в изучении нейронов вычислений в естественных условиях.
Хирургическое вмешательство необходимо разоблачить и маркировать мозг мыши для работы с изображениями. Клетки трансфицировали, как правило, с использованием рекомбинантного адено-ассоциированный Vir нам (AAV) система для Geci доставки и черепной окна имплантируется в течение месте инъекции, чтобы получить оптический доступ к мозгу. Глава бар затем прикрепляется к черепу для головы фиксации под двухфотонного микроскопа. На разработку и внедрение этих шагов имеет решающее значение, поскольку большинство проблем с активного воображения возникают из нестабильности в подготовке. В идеале процедура, описанная здесь должна позволять хронической визуализации до нескольких месяцев после операции.
Чтобы включить визуально руководствуясь поведение во время съемки двухфотонного, глава фиксированной мышь сидит на воздушной поддержке сферической беговой дорожке, которая может использоваться для перемещения виртуальной среды реальность. Передвижение мыши на беговой дорожке соединен с движением в виртуальной среде, которая отображается на тороидальной экране, окружающем 14,15 мыши. Поведенческие переменные, такие как передвижения, визуальный стимул, и положение зрачка могут быть записаны 6.
т "> Описаны процедуры, связанные с хронической двухфотонного изображений на мышах, исследуя виртуальную среду реалити Ключевые моменты рассмотрены следующие:. сокращение артефактов движения, сокращение светового утечки, максимизация количества одновременно записанных клеток, и минимизация повреждение фото. Мы также представить подробную информацию о настройке воздуха поддержке беговую дорожку, отслеживание зрачка, и виртуальную среду реальность. Процедуры, описанные здесь, могут использоваться для работы с изображениями флуоресцентно меченных клеточных популяций в голове фиксированных мышей в потенциально широкого спектра поведенческих парадигм .Protocol
Representative Results
Discussion
Ключ к успеху поведенческой изображений двухфотонного является стабильность препарата в двух направлениях:
- В течение суток после окна имплантации, воспалительные реакции из ткани может привести к усилению формирования грануляционной ткани и хряща, которые будут затруднять и?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом Фридриха Miescher Института медико-биологических исследований, Общества Макса Планка, и науки программы по правам границ.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
Referencias
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
