Summary

Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

Published: February 20, 2014
doi:

Summary

Hier beschreiben wir die in Zwei-Photonen-Bildgebung von Maus Cortex während Verhalten in einer Umgebung der virtuellen Realität beteiligt experimentellen Verfahren.

Abstract

In den letzten Jahren hat Zwei-Photonen-Imaging ist ein wertvolles Werkzeug in den Neurowissenschaften, wie es für chronische Messung der Aktivität von genetisch identifizierten Zellen während Verhalten 6.1. Hier beschreiben wir Methoden, um Zwei-Photonen-Imaging in Maus Kortex, während das Tier navigiert ein Virtual-Reality-Umgebung. Wir konzentrieren uns auf die Aspekte der experimentellen Verfahren, die Schlüssel in einem Tier verhalten in einem hell erleuchteten virtuellen Umgebung Bildgebung sind. Die wichtigsten Probleme, die in diesem Versuchsaufbau, dass wir hier sind, entstehen Adresse: Minimierung Gehirn Bewegung bezogenen Artefakte minimiert Lichtaustritt aus der virtuellen Realität Projektionssystem und der Minimierung der laserinduzierten Gewebeschäden. Wir bieten auch Beispiel-Software, um die Virtual-Reality-Umgebung zu steuern und Schüler Tracking zu tun. Mit diesen Verfahren und Mittel sollte es möglich sein, einen herkömmlichen Zwei-Photonen-Mikroskop zur Verwendung in Mäusen verhalten konvertieren.

Introduction

Zwei-Photonen-Imaging von Calcium-Indikatoren (genetisch wie GCaMP5 7 oder R-GECO 8, oder synthetische Farbstoffe wie OGB oder Fluo4 kodiert) als leistungsfähige Methode zur Messung der neuronalen Aktivität in Mäusen verhält 6.1 entstanden. Sie ermöglicht die gleichzeitige Messung der Aktivität von Hunderten von Zellen mit nahezu einzelnes Aktionspotential Auflösung, bis zu etwa 800 &mgr; m unter der Hirnoberfläche 9,10. Darüber hinaus mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) neuronale Aktivität gemessen werden kann chronisch 5,11,12 und in genetisch definierten Zelltypen 13. Zusammen bieten diese Methoden einen Grad an zeitlicher und räumlicher Auflösung, die sich eröffnen eine Vielzahl neuer Möglichkeiten bei der Untersuchung von neuronalen Berechnung in vivo.

Der chirurgische Eingriff ist notwendig, um für die Bildgebung aussetzen und beschriften Sie die Maus Gehirn. Zellen werden typischerweise unter Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten vir transfizierten us (AAV)-System für GECI Lieferung und kranial Fenster auf die Injektionsstelle implantiert, um einen optischen Zugang zum Gehirn zu erhalten. Ein Kopfleiste wird dann an den Schädel für Kopf-Fixierung unter der Zwei-Photonen-Mikroskop angebracht. Das Design und die Implementierung dieser Schritte ist kritisch, da die meisten der Probleme, wach Bildgebung ergeben sich Instabilitäten bei der Herstellung. Idealerweise sollte für chronische Abbildung von bis zu mehreren Monaten nach der Operation die hier beschriebene Vorgehensweise zu ermöglichen.

Um visuell geführte Verhalten während der Zwei-Photonen-Imaging ermöglichen, sitzt der Kopf fixiert Maus auf einem Luft unterstützt Kugellaufband, die sie verwenden können, um eine virtuelle Realität Umgebung zu navigieren. Locomotion der Maus auf dem Laufband ist, um die Bewegung in der virtuellen Umgebung, die auf einem Ring Bildschirm rund um die Maus 14,15 angezeigt wird, gekoppelt. Verhaltensvariablen, wie Fortbewegung, visuellen Reiz und Pupillenposition aufgezeichnet 6 werden.

t "> Wir beschreiben die Verfahren bei chronischen Zwei-Photonen-Imaging bei Mäusen Erforschung einer virtuellen Umgebung beteiligt Die wichtigsten Punkte angesprochen werden:. Reduzierung von Bewegungsartefakten, Reduzierung der Licht Leck, Maximierung der Anzahl der gleichzeitig aufgenommenen Zellen, und die Minimierung der Foto Schäden. Wir bieten auch Informationen über die Einrichtung des luftgestützten Laufband, Schüler-Tracking und die Umgebung der virtuellen Realität. Die hier beschriebenen Verfahren können zur Abbildung fluoreszenzmarkierten Zellpopulationen im Kopf fixiert Mäuse in einer möglicherweise Vielzahl von Verhaltensparadigmen verwendet werden .

Protocol

Alle Tier Verfahren wurden genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Veterinärdirektion des Kantons Basel-Stadt durchgeführt. 1. Hardware-und Software-Setup Zwei-Photonen-Scanning-Mikroskop-Setup: Verwenden eines gepulsten IR-Laser als Beleuchtungsquelle (Pulsbreite <120 fs). Verwenden Sie einen Scankopf eines 8 oder 12 kHz Resonanz-Scanner und ein Standard-Galvanometer Hinweis aus:. Dies ermöglicht Bildraten von 40 oder 60…

Representative Results

Die Bildqualität in Zwei-Photonen-Calcium-Imaging von Zellpopulationen mit einer markierten GECI hängt weitgehend von der Qualität der Schädel Fenster Implantats. Zwei Wochen nach der Virusinjektion in die Schädelfenster sollte für Klarheit geprüft werden. Es sollte kein Granulationsgewebe oder Knochen Nachwachsen sichtbar (Abbildung 1A) sein. Darüber hinaus sollte das Muster der oberflächlichen Blutgefäße unverändert bleiben und die Grenzen des Gefäßsystems sollte scharf sein. Zur gleiche…

Discussion

Der Schlüssel zum Erfolg des Verhaltens Zwei-Photonen-Bildgebung ist die Stabilität der Zubereitung in zwei Arten:

  1. Im Laufe der Tage nach der Implantation Fenster können entzündliche Reaktionen des Gewebes auf die Verbesserung der Bildung von Granulationsgewebe und Knorpel, behindern oder sogar verhindern Bildgebung führen wird.
  2. Während des Experiments das Gehirn ausreichend stabil, um Bewegungsartefakte zu korrumpieren neuronalen Aktivität verbunden Fluoreszenzsignals zu verhindern.
  3. <…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Friedrich-Miescher-Institut für biomedizinische Forschung der Max-Planck-Gesellschaft, und der Human Frontiers Science Program unterstützt.

Materials

cover slips (d = 3-5 mm) Menzel window implant
InSight DeepSee laser Spectra-Physics microscope
12kHz resonance scanner Cambridge Technology G1-003-30026 microscope
Galvometer Cambridge Technology G6215H microscope
Digitizer National Instruments NI 5772 microscope
FPGA National Instruments PXIe 7965R microscope
Acquisition card National Instruments PCIe 6363 microscope
Emission filter 525/50 Semrock FF03-525/50-25 microscope
Piezo-electric z-drive Physikinstrumente P-726.1CD microscope
Controller for piezo-electric drive Physikinstrumente E665 LVPZT microscope
Objective 16x, 0.8NA Nikon CFI75 microscope
Current amplifier Femto DHPCA-100 microscope
Photomultiplier tube Hamamatsu microscope
USB Camera without IR filter ImagingSource DMK22BUC03  pupil tracking
Objective 50 mm ImagingSource M5018-MP  pupil tracking
Macro adapter rings ImagingSource LAexSet pupil tracking
Optical computer mouse Logitech G500 motion tracking
Styrofoam ball 20 cm e.g. idee-shop.de 08797.00.15 virtual environment
LED projector Samsung SP-F10M  virtual environment
Acquisition card National Instruments NI 6009 virtual environment
Panda3D game engine www.panda3d.org virtual environment
Numpy library for Python www.scipy.org virtual environment
Scipy library for Python www.scipy.org virtual environment
NI-DAQmx driver National Instruments www.ni.com virtual environment
Ultrasound gel Dahlhausen 5701.0342.10 imaging

Referencias

  1. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
  2. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
  3. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  4. Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
  5. Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
  6. Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
  7. Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  8. Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  9. Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
  10. Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
  11. Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  12. Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
  13. Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  14. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  15. Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
  16. Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
  17. Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
  18. Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
  19. Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
  20. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  21. Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).

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Leinweber, M., Zmarz, P., Buchmann, P., Argast, P., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Keller, G. B. Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment. J. Vis. Exp. (84), e50885, doi:10.3791/50885 (2014).

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