Denne orthotopic modell av human prostatakreft muliggjør kvantifisering av tumorstørrelse, sirkulerende svulstceller, og dannelse av metastaser distinkt til lungen. Som celler må unnslippe den primære organ, inn i blodstrømmen, og implantat inn i en sekundær side, denne modellen sammenfatter effektivt scenariet hos mennesker.
Vårt laboratorium har utviklet en ny orthotopic implantasjon modell av menneskelig prostatakreft (PCA). Som PCA døden skyldes ikke den primære tumor, men dannelsen av distinkte metastase, er evne til effektivt å modellere denne progresjon pre-klinisk er av høy verdi. I denne modellen, blir cellene direkte implantert i ventral flik av prostata i Balb / c atymiske mus, og lov til å utvikle seg i 4-6 uker. Ved terminering av eksperimentet, kan flere adskilte endepunkter skal måles, slik som størrelse og molekylær karakterisering av den primære tumor, tilstedeværelse og kvantifisering av sirkulerende kreftceller i blod og benmarg, og dannelse av metastaser i lungene. I tillegg til en rekke endepunkter, gir denne modell et bilde av et cellene evnen til å invadere og unnslippe primære organ, fyll og overleve i sirkulasjonssystemet, og implantatet og vokse i en sekundærside. Denne modellen har blitt brukt effektivt til å måle metastatiskrespons på både forandringer i protein ekspresjon, så vel som til svar på små molekyl legemiddel, i en kort behandlingstid.
Prostatakreft (PCA) er den vanligste diagnosen kreft hos menn, og den nest største årsaken til kreftdød i USA en. Død av PCA er ikke på grunn av dannelsen av den primære tumor, men dannelsen av metastaser. Derfor er forebygging av metastaser hos pasienter med høy viktighet. Musemodeller av PCA tilby et mangfold av muligheter for å avdekke kritiske biologisk informasjon om denne sykdommen.
En rekke musemodeller av PCA eksisterer, hvert med iboende fordeler og begrensninger. Selv om frekvensen av PCA hos mennesker er høye, er naturlig forekommende PCA svært uvanlig hos mus 2, til tross for lik følsomhet hos mus samlet til kreft 3.. En gnager Unntaket er utviklingen av PCA i Lobund Wistar rotter, som kan oppnå priser av PCA av 90% ved 12 måneders alder via induksjon av methylnitrosourea og testosteron fire. Av denne grunn induseres modellsystemer, slik som TRAMP(Transgene adenokarsinom av musen prostata) modell blir ofte brukt. Den TRAMP modellen kan indusere transgene uttrykk spesielt i prostata, og gjennomgår normal progresjon av PCA, fra hyperplasia til prostatahyperplasi intraepitelial neoplasi (PIN) til lymfesystemet og lungemetastaser 5-6. Disse modellene gir fordelene med å være i stand til å måle et bredt spekter av tumorprogresjon, samt inneholder et intakt immun-system. Imidlertid kan de molekylære hendelser underliggende PCA utvikling skiller mellom mus og mennesker, og korrelasjoner mellom mus og kliniske studier har vist variabilitet. I tillegg er begge disse modellene er tidkrevende, som et eksempel på TRAMP modellen krever omtrent 28 uker for å utvikle metastasering.
I å studere metastasering, er ofte en hale-vene eller venstre ventrikkel injeksjon modell som brukes. Denne modellen fordelen av hurtig behandlingstid, og kan i tillegg måle tilstedeværelsen av bein metastaser ved hjelp av spesifikke cellelinjer og betingelser. Yang et al. Har rapportert at subkutan injeksjon av GFP-positive PC3 celler kan føre til mye spredt bein metastase 7, og halevenen og intercardiac injeksjoner har også generert bein metastaseutvikling 8-9. De store begrensninger av disse modellene er knyttet til mangel på en primærtumor som befinner seg innenfor prostata i seg selv. Videre, for modeller avhengige på injeksjon av cancerceller inn i sirkulasjonen, omgår denne hele første halvdel av metastatisk kaskade. Det utelukker dermed undersøkelse av første trinn, herunder invasjon gjennom den primære organ, som er biologisk viktige tiltak av metastatisk transformasjon. Mange regulatorer av metastatisk transformasjon direkte påvirke tidlig celle invasjon. Tidlige trinn i metastatisk kaskade utgjør høyt prioriterte områder for terapeutisk målretting, som når kreftceller spre, utvider klonal variasjon sterkt, og dermed øke biologiskal mangfold og avtagende effektiv terapeutisk målretting.
I et forsøk på å reagere på mange av begrensningene i disse modeller, har vårt laboratorium utviklet en orthotopic modell av human PCA hvori human PCA PC3-M cellelinjen er direkte implantert inn i prostata av Balb / c atymiske mus. Etter 4-6 uker, kan tumorstørrelse, tilstedeværelse av sirkulerende tumorceller (CTCS), og metastaser i lungene og lymfekjertlene alle bli kvantifisert. Vi har effektivt brukt denne modellen for å evaluere effekten av 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (genistein) for å hemme human PCA metastase 10. Kost forbruk av genistein har vært knyttet til reduksjon i prostatacancermetastase eller død 11-12, men har tidligere ikke studien hadde fastslått hvorvidt administrering av genistein kan endre PCA metastase hos dyr eller mennesker. I denne studien demonstrerte vi at behandling med genistein sterkt redusert antall lungemetastaser. I tillegg bestemmes vi genistein alholds aktivering og ekspresjon av flere viktige pro-metastatiske proteiner i den primære tumor, inkludert fokal adhesjon kinase (FAK), p38-mitogen-aktivert protein kinase (p38 MAPK) og varmesjokkprotein 27 (HSP27).
Disse resultatene samsvarer med observasjoner i klinikken. Ved hjelp av blod hentet fra mus, var vi i stand til å måle konsentrasjonene av genistein blod og observert disse til å være lik nivå hos mennesker med vanlig kostholdsråd for inntak av genistein. I tillegg, en fase II studie utført av vår gruppe bestemmes at ved behandling med genistein, menn opplevde nedgang i prostatavevet mRNA uttrykket av gener assosiert med mobilnettet invasjon og metastasering, spesielt matrise metalloproteinase type 2 (MMP-2) 13.
Vi har også benyttet denne modellen for å evaluere effekten av endret gen-produkt-uttrykk i den primære tumor på human PCA metastase 14. Svulsten dempetEssor endoglin er medlem av TGFβ super og undertrykker menneskets PCA cellulær invasjon in vitro via endring av Smad signale 15. Vi utvidet disse studier for å fastslå effekten av endoglin på menneskelig PCA metastasering. Stabil endoglin knockdown, vektor kontroll eller endoglin over uttrykk cellelinjer ble implantert i mus. Endoglin knockdown celler viste det høyeste antall lunge-metastase, samt CTCs i 38% av musene. Mus implantert med kontrollvektor viste en middels reaksjon, med mindre lungemetastase per mus, og CTCs i bare 18% av musene. Høy endoglin implantert mus viste nesten fullstendig undertrykkelse av lungemetastaser, og fullstendig undertrykkelse av CTCs.
Dette er bare to eksempler på det brede utvalget av applikasjoner denne teknikken har. Fra drug discovery, til modellering endringer i molekylær biologi, tilbyr denne modellen en høy gjennomstrømning metode for å vurdere effekten av ulike funksjoner på tumorvekst og muldvarpsielt endringer, tilstedeværelse av CTCs, og dannelse av distinkte metastaser i lunge og lymfeknuter.
I denne artikkelen gir vi en roman murine modell av menneskelig PCA metastasering. I denne modellen, er den menneskelige PCA cellelinjer PC3-M orthotopically implantert direkte i prostata av Balb / c atymiske mus og svulster får utvikle seg i 4-6 uker. I den representative resultater delen, viser vi eksempler på data som kan samles, inkludert musevekt og matforbruk, tumorstørrelse og vekt, molekylære egenskaper av svulsten, og dannelse av metastaser distinkt til lungen. I tillegg kan en rekke ytterligere utganger bli studert, avhengig av spesielle forskningsinteresse. Et eksempel er tilstedeværelsen av CTCs til blod og benmarg. Som CTCs er en relativt sjelden hendelse (vi observerer CTCs i ca 5-20% av kontrolldyrene), var vi ikke overrasket over at ingen av de fem mus i disse forsøkene utviklet CTCs. Vårt laboratorium har også brukt denne modellen til å oppfatte endringer i cellulær adhesjon ved å måle kjernefysisk cellemorfologi iprostatavevet 10. Vi har også brukt denne modellen til å vurdere primærtumor spredning og apoptose status ved hjelp av Ki67 og TUNEL farging av prostata svulst 14.
I tillegg til det store utvalg av datautganger som kan oppnås, kan denne modellen kan brukes til å bestemme virkningen av begge forandringer i protein ekspresjon, så vel som små molekyl terapeutika. Sammenlignet med mange spontane og induserte modeller av human PCA metastasering, er det en høyere behandlingstid på bare 4-6 uker. Andre modeller med en høy behandlingstid, slik som halevenen eller intercardiac injeksjon modeller, har begrensninger av noen primære svulsten, og dermed ikke fullt rekapitulere klinikken metastatisk kaskade. I vår modell, må kreftceller unnslippe det primære stedet for opprinnelse, inn og overleve sirkulasjonssystemet, og implantat inn i en sekundær stedet. Dette gir ekstra trinn på som en terapeutisk intervensjon eller endring i protein uttrykk kunne levere en effekt. Addinalt, bør nærvær av den primære tumor tillater enkel anvendelse av denne modell for nye avbildningsteknologier slik som luciferase-baserte IVIS 16-17.
Til tross for det store utvalget av fordelene med denne modellen, er det også flere begrensninger for å vurdere. Et økende antall studier viser betydningen av immunsystemet i tumoren mikromiljøet, og utvikling av metastasering 18.. I denne modellen, som følge av bruken av en atymisk gnagere, er det ikke mulig evne til å vurdere virkningene av immunsystemet. En annen begrensning er mangelen på androgen respons i PC3-M celler. Ved første diagnose av PCA, pasienter ofte vil gjennomgå androgen terapi som en førstelinjebehandling. Imidlertid vil pasientene til slutt bli androgen-resistente svulster og vil begynne å vokse igjen. Som PC3-M celler mangler androgen reseptoren, denne modellen kun måler effekten av medikamentell behandling eller protein modulering på post-androgen motstandsdyktig cancer. Selv om dette er en begrensning, er androgen-responsive PCA tiden godt håndterlig, og har en rekke effektive behandlingstilbud, og dermed androgen-resistente kreft har blitt mer fremtredende studert. Denne modellen har også spesifikt bruker en innavlet stamme av mus, noe som minimerer mus til mus variabilitet. Imidlertid kan denne belastningen være spesielt lydhør overfor spesielle proteiner eller små molekyler, og dermed omsorg bør tas når ekstrapolere disse dataene til klinikken.
Selv om denne modellen gir en effektiv måling av legemidlets effekt i en hurtig behandlingstid på 4-6 uker, kan det ikke ta hensyn til langtidsmedikamentdoserings effekter. Etter lengre tids eksponering for mange tilgjengelige behandlinger, kan pasientene tilbake med mange år etter behandling resistente kreftformer. Den raske snuoperasjon av denne teknikken ikke tillater effektiv modellering av muligheten for en svulst å bli resistente mot en behandling. Men med modulering av denne exForsøket kan behandlingsresistente humane prostatakreftceller implanteres, og effektiviteten av et andregenerasjons terapeutisk for å hindre PCA tumorvekst og metastasering kan modelleres. I tillegg, hvis en gruppe forsøkte å studere molekylære endringer i en primærtumor over tid, en mer langsiktig modell som TRAMP modellen vil sannsynligvis være mer effektive for disse studiene.
En annen begrensning av denne modellen er formidling av distinkte metastaser kun til lymfeknuter og lunger av dyrene. Begge disse områdene er hyppige og klinisk relevante områder av metastasering, som demonstrert av menneskelig varme obduksjon studier 19. Imidlertid utgjør klinisk bein metastase et fremtredende trekk ved menneske PCA, og dermed modellene rekapitulere dette er av interesse. Dessverre er dette vanskelig å rekapitulere i en musemodell, med svært få modeller som viser beinmetastaser uten hale vene, intercardial injeksjon, eller direkte implantasjon itil beinet 20. Således hvis målretting til benet er av sentral betydning eksperimentelt, kan en annen modell være mer effektive. Men denne modellen gir en viss grad av trafikk til benet i form av benmarg sirkulerende tumorceller.
Til tross for disse begrensninger, er denne teknikken en kraftig modell av human PCA. Evnen til å måle virkningene av både den primære tumor og metastatisk formasjonen i en kort behandlingstid gir et bredt spekter av anvendelser. I denne modellen, må celler unnslippe det primære organet, inn og overleve i blodet, og implantat i en sekundær side, rekapitulere prosessen hos mennesker. Den ytterligere måling av molekyl egenskapene av den primære tumor, endringer i cellemorfologi, og tilstedeværelse av sirkulerende tumorceller gir et bredt pust av informasjon fra en modell. Denne fremgangsmåten kan anvendes både i forbindelse med medisiner, samt til å studere forandringer i tumorbiologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) til RCB, CA122985 og prostata SPORE CA90386, og til JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Opplæring i Age-Related Disorders", og ved Walter S. Og Lucienne Driskill Graduate Program i miljø-og biovitenskap ved Northwestern University. Vi vil også gjerne takke Mouse fenotyping og Histologi Laboratory og patologi Kjerne Facility ved Northwestern University.
Equipment | |||
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4″) | VWR | 95039-192 | |
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2″) | VWR | 94000-000 | |
Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27″ | Ethicon | Z304H | |
VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2″) | VWR | 82027-440 | |
Reagents | |||
Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
Buprenex | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
Formalin | VWR | 95042-908 | |
GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
Nembutal | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
Trizol | Invitrogen | 10296 |