在体外试验 ，以评估免疫调节途径对HIV特异性CD4 + T细胞效应功能的影响
Summary
我们开发了一种体外测定，调查免疫调节途径中的细胞因子分泌的HIV特异性CD4 + T细胞的调节中的作用。
Abstract
T细胞耗竭是在慢性病毒感染的主要因素未能病原清除。免疫调节途径，如PD-1和IL-10，被上调时这种持续抗原暴露，并有助于损失扩散，降低溶细胞功能，并削弱细胞因子的产生由CD4和CD8 T细胞。在LCMV感染的小鼠模型中，封闭抗体对抗这两种途径增强T细胞应答的管理。然而，目前还没有在体外测定来测量这类封锁对细胞因子分泌的人类样本的影响在细胞。我们的协议与实验方法使我们能够准确，有效地量化因子的产生由艾滋病毒感染者HIV特异性CD4 + T细胞的恢复。
在这里，我们描述了体外实验的设计，使细胞因子分泌的测量由HIV特异性CD4 + T细胞及其对其他CEL的影响升子集。 CD8 + T细胞从全血耗尽，剩下的外周血单核细胞经聚蔗糖分离方法分离。 CD8贫化的PBMC再孵育阻断抗体对PD-L1和/或IL-10Rα，并刺激与HIV-1 Gag肽池后，将细胞培养在37℃，5％CO 2。 48小时后，弃上清，用有孔玻璃珠阵列和细胞沉淀收集的细胞因子分析，使用流式细胞术或转录分析利用定量RT-PCR方法收集或表型分析。如需更详细的分析，不同的细胞群从外周血单个核细胞选择性的子集枯竭或使用流式细胞仪正在评估在相同的实验前分选获得的。这些方法提供了一个高度敏感和特异的方法由抗原特异性T辅助细胞以确定细胞因子产生的调节，并确定免疫细胞的不同种群之间的功能性相互作用。
Introduction
在持续的病毒感染，病毒特定的T细胞获得被称为T细胞耗竭过程的功能缺陷。早在慢性病毒感染的小鼠LCMV模型的体内研究表明，耗尽病毒特异性T细胞具有降低溶细胞功能针对病毒感染的细胞，失去它们的增殖能力和减少容量，以产生细胞因子如IL-2，TNF-α α和IFN-γ1,2。免疫途径，如PD-1和IL-10的一个复杂的网络，在慢性感染上调，促进T细胞功能障碍（在3,4审查）。 在封闭抗体对这些抑制途径在LCMV小鼠体内给药模型恢复耗尽病毒特异性T细胞的功能和增强的病毒清除率，表明T细胞耗竭是部分可逆的现象（在5评论）。
在日的调查结果ËLCMV模式被迅速推广到人类慢性病毒感染，如乙肝，丙肝和艾滋病病毒5。在慢性HIV-1感染，PD-1和IL-10途径的上调在感染的受试者和疾病进展的参数相关联，并直接与病毒载量成反比与CD4计数6-8。对PD-1或IL-10途径的 HIV-特异性CD4和CD8 T细胞的体外增殖恢复表明，类似于LCMV小鼠模型，在人体T细胞耗竭是部分可逆的现象的抗体阻断。然而，由于对人的样品实验微妙的性质以及在体外试验中，通过这些措施达到的功能恢复访问彻查的灵敏度局限性是显着存在。增殖试验已经，到目前为止，唯一可靠的体外测定在大多数研究中进行测试，但是有一个显着的证据不足对这些相互的影响关于干预措施：细胞毒性T细胞的1）的杀灭能力，2）T细胞对病毒复制的抗病毒效果，3）的细胞因子分泌的空间，以及4）对其他细胞亚群的CD4 T细胞的辅助作用。
细胞内细胞因子染色（ICS）是一种非常有用的和广泛使用的流式细胞仪为基础的检测，用于检测在小鼠和人类的各种细胞类型的细胞因子的产生。它也被用于研究抑制途径的抗体阻断的效果。在ICS的分析，细胞因子分泌受阻，加入菌素和/或莫能菌素的。细胞因子被困在细胞内，然后与用多色流式细胞术荧光抗体检测。该测定法的持续时间通常限制在抗原刺激后6或12小时，因为这两个布雷菲尔德菌素和莫能菌素，它们通常在2小时内抗原另外的添加，是对细胞有毒。 ICS的试验是一个强大的技术，一直是我非常有用n个封闭抗体干预在细胞一段时间抗体暴露后9提取后的小鼠体内给药的效果进行调查。但是，也有对本实验方法的应用来评估抑制性受体人样品中的封锁的影响一些局限性。当执行抑制途径的体外一个6或12小时的刺激（通常与人类样本的情况下）抗体干预，抑制性受体在大多数情况下的封锁如通过标准测定法ICS测量不改变反应的抗原特异性T细胞的频率6，7。每个细胞的细胞因子产生的作为由平均值或中位数荧光强度测量结果已经给出不一致的结果，6，7，10。另一方面，ICS时后在一晚的时间点进行刺激（ 即 6天），改变细胞因子分泌的c数英语学习者可以观察到。不同之处的改变增殖，存活，并积累在一段6在指定期间内效应器功能变化的综合结果。以部分地克服这些局限性的一种方法是孵育时间较长（ 例如 36小时，60小时等 ），与另外的细胞因子分泌阻断前的抗原，而无需等待扩散发生。我们已经成功地使用这种方法，通过HIV-特异性CD4和CD8 T细胞11,12，以确定细胞因子分泌的动力学，但是，这种方法是不能够检测到小的反应，也不会给予的总细胞因子的分泌产生的积分结果因为刺激。因此，ICS是不是足够敏感的方法检测抑制通路的阻断对细胞因子与细胞因子mRNA的定量或分泌细胞因子的测量在supernatan相比，由活化的T细胞产生量的影响吨在同一时间点。此外，大多数由活化的T细胞产生的细胞因子，通过促进或正或负反馈作用的自分泌方式循环通过与抗原呈递细胞相互作用。因此，除了菌素或莫能菌素的ICS测定期间防止细胞因子的分泌，因而T细胞的刺激不是最佳的。最后，检测多种细胞因子与ICS的是由可用的和抗体的灵敏度进行检测的细胞因子流式细胞术，以及通过荧光染料，可以同时使用在任何给定的面板的数目的限制的限制。
我们开发了一种高度灵敏的体外试验方法，评价在由HIV特异性CD4 + T细胞调节细胞因子的分泌，并随后CD4辅助抗原呈递细胞（APC）和自然杀伤细胞（NK细胞）免疫途径的影响。此方法也可用于评估IMPA克拉消耗者从外周血中CD4 + T细胞，或通过与最优肽只能由CD8 + T细胞识别上的刺激CD8 + T细胞功能的抑制分子的封锁。相反，细胞内细胞因子染色测定法，我们决定不与细胞因子分泌的HIV特异性CD4 + T细胞干预，以便能够：1）执行所产生的细胞因子水平的更精确的量化; 2）调查更广的面板细胞因子或效应分子，以及3）评价由HIV特异性CD4 + T细胞上的其他细胞亚群产生的细胞因子产生的影响。我们刺激CD8耗尽外周血单个核细胞，在封闭抗体对感兴趣的免疫调节途径的存在HIV-1 Gag肽池。孵育后，通常48小时所需要的时间，我们收集上清液测定细胞因子的分泌与磁珠阵列和收集细胞沉淀无论是对不同的细胞亚群的表型分析或转录分析。的注意，在t其48小时的时间点，不检测增殖T细胞12的显著人口。这是一种灵活的方法，该设计的几个适配可以应用于解决不同的假设。例如，单独的细胞亚群（如HIV特异性CD4 + T细胞或PD-1的高CD4 + T细胞， 等等 ）可以在进一步孵育36小时，然后收集上清液和细胞沉淀物的12小时温育后进行排序调查更具体的封锁措施对细胞因子分泌的外周血单个核细胞亚群定义的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
收集上清液这是实验设计的一个必要组成部分。当收获上清液用于与Luminex测定中，等分试样制作并保存于-80℃，以防止蛋白质降解是由于冻融循环。冻融可以苛刻的进程蛋白质，并通过最小化冷冻解冻，信号将被最大化的检测。因此，它更容易从已冻融的次数相同等份工作时，得到可重复的和更准确的数据。
之前我们已经进行细胞因子的分泌和mRNA水平的动力学分析刺激与HIV…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢戈登·弗里曼提供抗PD-L1的封闭抗体。我们感谢的临床和实验室工作人员在美国马萨诸塞州总医院和所有的研究参与者在这个项目中的不可估量的作用。
，国家心肺和美国国立卫生研究院血液研究所（RO1 HL-092565; DEK），这项研究是由国家过敏研究所和美国国立卫生研究院（DEK PO1 AI-080192）的传染病支持。 DEK是由魁北克卫生研究基金的研究学者成就奖（FRQS）的支持。 FP是由马萨诸塞州总医院执行委员会的研究和哈佛全球健康研究所（HGHI）的奖学金资助。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Referencias
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