Técnica de Estudos de Artrópodes e comunidades microbianas dentro Árvore Tecidos

1. Floema Seleção e remoção de árvore Escolha uma árvore com características particulares. Colete floema de pinheiros (ou seja, árvores do gênero Pinus), como eles têm uma camada distinta floema que é de vários milímetros de espessura. 18,27 Uma vez que uma árvore está localizado que tem poucos ramos mais baixos, verifique se existem outros defeitos, tais como ataques de insetos e / ou patógenos. Como alternativa, use floema de outras árvores coníferas, como abetos em sanduíches floema. 9 Outras espécies árvores pode ser adequado para a remoção do floema, como madeiras. NOTA: As árvores coníferas com grandes coroas têm tipicamente o mais grosso tecido floema. Para maximizar a quantidade de floema, o melhor é cortar árvores que têm poucos defeitos e galhos no tronco (fuste). Espécies de pinus que são obra de auto-poda melhor. Floema é tipicamente mais espesso durante a estação de crescimento e é mais espessa mais acima no tronco do que perto do chão. Floema às vezes é difícil remove das árvores durante o outono ou inverno. Cortar uma árvore para baixo ou usar os logs recentemente cortadas para obter floema. Escolha uma direção de queda que irá minimizar os danos à árvore, bem como árvores próximas. Ramos cortar o tronco para facilitar o acesso a materiais de casca durante a remoção do floema. Uma vez que uma árvore é cortada (derrubadas; caiu no chão) começar a raspar a casca do tronco com uma lâmina afiada empate (Fig 1A.). Raspe uma área da casca fora até que a camada de floema é atingido. NOTA: A camada de floema é tipicamente de cor mais clara (por exemplo, cor de creme) e úmido, enquanto a casca externa é mais seco e de cor mais escura (Fig 1B.). Tome especial cuidado para não raspar o floema. A área raspada da casca depende do tamanho da peça (s) necessária floema. Depois que a casca é removida, cortar um esboço da peça floema com uma faca afiada. Certifique-se que a faca corta todo o caminho para o xilema (Fig. 2A). Para remover o floema, começar em um canto da peça floema usando os dedos para descascar cuidadosamente de volta o floema. Use uma faca para ajudar a raspar o floema fora do xilema. Continue puxando o floema fora até que toda a peça é removida. NOTA: Floema normalmente descasca fora da árvore mais fácil no verão. Para floema que é extremamente difícil de remover, uma ferramenta em forma de espátula pode auxiliar no esforço. Coloque o pedaço floema imediatamente em um saco estéril. Para melhores resultados, feche o saco de vácuo (Fig. 2B) ou, se o uso de sacos Ziploc, retire todo o ar do saco. Isto aumenta a longevidade do floema. Opcionalmente, colocar várias peças de floema em um saco. Floema loja em sacos hermeticamente fechados ligeiramente acima de zero (entre 1 e 10 ° C) para manter a sua frescura. 2. Criar o sanduíche Floema Corte dois pedaços iguais de acrílico transparente, policarbonato ou material similar duro, claro (por exemplo, vidro), um pouco grander que o pedaço de floema (Fig. 2C). Redondo as bordas do acrílico para prevenir os cantos de rasgar o selo Parafilm. Este protocolo usa um 1/8 em. Acrílico transparente de espessura. NOTA: O tamanho das peças cortadas depende das necessidades do organismo e sujeito a duração do estudo. Por exemplo, um par de besouros utiliza 4 dm 2 de floema durante um período de meses, mas só vai precisar de um dm 2 se o estudo tem lugar dentro de alguns dias. Perfurar um furo em uma das peças de acrílico para permitir a entrada de organismo (s) de estudo. O tamanho e número de furos depende dos objectivos (Fig. 2D). Antes de colocar o floema entre as peças de acrílico, esterilizar a superfície de acrílico (com> 70% de etanol), ou, se estiver usando o novo acrílico, retire a película protetora. Coloque o pedaço de queijo fresco de floema entre as peças acrílicas estéreis. Oriente a parte acrílica com o furo (s) no lado interior ou exterior do floema, whichever é necessária. Tipicamente, voltado para a parte exterior do floema (lado que tinha nele casca) para os orifícios de entrada. 3. Vedação da Sandwich Floema Para criar um selo temporário em torno da sanduíche floema, em utilizar 2. Parafilm tiras largas puxados em torno dos bordos da sanduíche de floema (Fig. 2C). Como alternativa, usar um envoltório de cloreto de polivinilideno para selar as arestas. 6 Em seguida, colocar um grampo de cada lado da sanduíche para espremer o acrílico para o floema. Certifique-se que toda a superfície é apertado para baixo para evitar o espaço aéreo entre o acrílico e floema (Fig 2C). Se não fixada corretamente, as amostras podem mover-se entre o acrílico e floema. Para criar um selo semi-permanente adicionar um epoxi ou vaselina não-colagem em torno do floema. Certifique-se de que o material envolve completamente o floema. Em seguida, use grampos ou parafusos com parafusos (pode precisar de fazer furos antes do tempo) para manter o acrílico apertado ao floema.Os sanduíches apenas permanecer viáveis ​​por até um ou dois meses. Dependendo das necessidades de oxigénio dos organismos de estudo, adicionar um filtro de ar em um ou mais lados da sanduíche. Isto irá permitir que o ar a entrar na sanduíche floema, mas limitar a perda de água a partir do floema. Nós usamos filtros de carvão simples que também reduzem o risco de contaminação fúngica e bacteriana. Para as amostras de estudo que exigem a entrada e saída à vontade, substituir uma das peças de acrílico com madeira ou material similar que um inseto pode penetram. Isto é particularmente importante para a observação das sondas de madeira, porque, depois de o seu estado larval é completado na camada de floema, em seguida, eles perfuram o xilema. Para evitar cobaias de sair dos orifícios de entrada, coloque pequenas placas de petri (ou outros objetos, fita) sobre os buracos, fuga de bloqueio. Desde organismos que residem nesses espaços são habituar a níveis baixos de luz, pode ser necessário colocar os sanduíches em um quarto escuro ou caixa, ou o lugarmaterial de paque em cima para bloquear a luz. 4. Observando organismos no Sandwich Floema Introduzir espécimes de estudo no orifício de entrada do sanduíche floema (Fig. 2D). Observe as amostras usando um microscópio de dissecação sob uma luz vermelha ou luz branca fixada em um nível baixo (Fig. 2E). Para gravar as atividades ou o crescimento de espécimes dentro do sanduíche floema anexar uma câmera ou câmera de vídeo para o microscópio. Anexar câmeras de vídeo especiais para a ocular do microscópio (Fig. 2E & F). Por muito pequenos organismos, como ácaros, nematóides e pseudoscorpions, use uma câmera de vídeo de alta definição acoplada ao microscópio. Para gravar sons, microfones inserir dentro do orifício de entrada do floema sanduíche ou através do lado da sanduíche de floema. Uma vez que o orifício de entrada é pequena, utilizar um pequeno microfone tal como um microfone de condensador de electreto. Para gravar a partir do lado ou a superfície deo floema sanduíche usar um elemento piezo (Fig. 3B). Para reproduzir o som, use o mesmo elemento piezo ou anexar um transdutor tátil (excitador) para a superfície da parte superior ou inferior do acrílico.